科学审计更正（2026-07-19）：早期页面曾发布marker硬标签、CD4 T占主要比例和私有样本参照，这些内容已撤回。QC后68,551个细胞全部来自donor A。本文现不生成marker派生的离散身份，连续program只用于这份矩阵的结构描述。
PBMC 68k 是最常见的公开单细胞参考数据之一。它的规模适合观察大体免疫结构，也容易让人误以为细胞数量足够大就能直接发布稳定比例。本文把问题收窄到公开 filtered matrix 能支持的范围：QC 是否可读，Leiden 结构是否存在，连续免疫程序位于哪些区域，第二套 marker 是否同向，以及单 donor 对结论有怎样的限制。
论文、数据来源与复现边界
- 论文：Zheng et al., Nature Communications, 2017
- DOI：10.1038/ncomms14049
- 公开数据：10x fresh_68k_pbmc_donor_a
- 矩阵层：10x filtered gene-barcode matrix
本文复现的是 filtered matrix 层面的表达结构。它可以支持常规过滤、归一化、HVG、PCA、邻居图、UMAP、Leiden 和 marker program 检查，不能恢复 FASTQ、barcode calling、分子纠错、建库过程或原文全部平台性能评估。
数据规模与统计单位
QC 后保留 68,551 个细胞，工作对象包含 17,788 个基因。所有细胞来自 donor A，因此 cell 是观察单位，donor 是唯一的生物单位。大细胞数可以让这份矩阵的内部结构更清楚，却不能替代 donor 重复，也不能把 cluster 中位数转换成正常人群范围。
单 donor 条件还影响组成解释。任何连续程序的高低、cluster 的大小和某个区域的细胞密度，都只描述这份 filtered matrix。它们可用于设计后续项目的 marker 面板和质量检查，不能用于宣称 CD4 T、B cell、monocyte 或其他群体在普通外周血中的固定比例。
分析流程
读取 gene-barcode 矩阵后，检查细胞与基因方向，按公开矩阵层建立对象；结合 detected genes、UMI counts 和线粒体比例查看 QC；在当前对象内完成归一化、log 表达变换、特征选择、PCA、邻居图、UMAP 与 Leiden。marker program 分数在同一矩阵内计算，并与第二套 marker 进行分开比较。
本次 assignment program 包括 CD4_T、cytotoxic_T_NK、B_cell、CD14_mono、FCGR3A_mono、Dendritic 和 Megakaryocyte_platelet。CD8 T 与 NK 共用多种细胞毒 marker，因此本文将两者合并为一个 cytotoxic T/NK 方向。这个合并用于避免仅凭 NKG7/GNLY/PRF1 造成过硬切分，不代表完整免疫 taxonomy。
QC：公开 filtered matrix 是否可读
filtered matrix 已经经过上游筛选，二次分析仍需检查表达量和检测基因分布。QC 图不回答细胞身份，也不提供群体比例；它回答的是当前矩阵是否存在明显异常的表达深度、检测基因数或线粒体比例结构。
从 QC 分布进入后续分析时，应把异常尾部保留下来用于复核，而不是只展示一个漂亮的中间区域。低检测量细胞可能影响 marker 稳定性，高线粒体比例可能提示质量问题，较高 UMI 也需要结合 doublet 或细胞大小考虑。公开 filtered matrix 的 QC 规则和本次二次过滤规则应在项目报告中分别记录。
这张图的证据范围停留在数据可读性。它不能证明所有表达都来自单一细胞，也不能替代 doublet、ambient RNA 或跨样本 QC。若后续项目有 donor 和实验批次，应把 QC 分布按生物单位拆开观察。
无监督结构：Leiden 先承担结构检查
QC 后的表达空间通过 PCA、邻居图和 Leiden 组织。Leiden cluster 是计算分区，编号本身没有生物学含义。它适合检查 PBMC 主干是否形成可见结构、低丰度方向是否出现，以及 marker program 是否集中在相应区域。
UMAP 上的区域可以作为后续 marker 审查的坐标。相邻位置表示当前表达表示相近，不能证明谱系、功能转换或细胞状态因果。cluster 的数量和边界依赖基因选择、邻居参数与随机初始化，也不能直接改写成 CD4 T、B cell 或 monocyte。
大规模数据的优势在这里体现为结构分辨率更高，风险也随之增加：一个连续轴可能被切成多个 cluster，少量共享 marker 可能让两个方向看起来接近。下一步需要使用连续 program 和分离 marker，而不是只看 cluster 颜色。
连续免疫程序的审计
当前不生成 marker-derived 离散身份。每个细胞都有最高 program 分数与 top-two margin，但没有跨数据集校准的绝对阈值，68,551 个细胞均保持 exploratory only 和 unassigned。
高分说明某套 marker 在当前细胞的表达方向更集中，差值小则说明两个或多个程序接近。它们是相对诊断量，不是身份概率。CD4 T、B cell、单核细胞和细胞毒性 T/NK 方向可以在不同区域形成差异，但不能从最高分直接得到细胞类型计数。
CD4_T 使用 CD3D/IL7R/CCR7，cytotoxic_T_NK 使用 NKG7/GNLY/PRF1，B cell 使用 MS4A1/CD79A/CD74，CD14 monocyte 使用 LYZ/S100A8/S100A9，FCGR3A monocyte 使用 FCGR3A/LST1/IFITM3，Dendritic 使用 FCER1A/CST3/HLA-DRA，血小板相关方向使用 PPBP/PF4/NRGN。这些基因组合用于描述程序，不是作者标签或流式结果。
程序在嵌入空间中的位置
连续分数着色可以帮助确认某一方向是否集中在某些表达区域，也能显示低分和混合区域。颜色不替代身份标签。
图中 T/NK、B、髓系、树突和血小板相关区域可能出现不同梯度。梯度适合用于定位候选区域和回看单基因表达，不能被解释成功能转换、谱系轨迹或人群中的固定组成。PBMC 中 CD8 T 与 NK 的共享 marker 还会让细胞毒性区域呈现连续性，这也是当前合并 cytotoxic T/NK 方向的原因。
如果同一位置有多套程序同时升高，后续应检查 doublet、ambient RNA、低质量和 marker 共享。若只有一套程序在少数细胞中升高，也要结合 detected genes、UMI 和独立 marker 复核。UMAP 颜色只提供线索，不承担最终定名。
第二套 marker 的一致性边界
assignment panel 与 held-out panel 分开计算。第二套 marker 不参与最高分生成，用于观察两个程序是否同向。它们共享同一批 donor A 细胞和同一个 filtered matrix，所以证据等级仍然是 same-matrix separate-marker consistency。
cytotoxic_T_NK 的 Spearman 相关约为 0.73，明显高于多数其他 program；CD4_T、B_cell、CD14_mono、FCGR3A_mono、Dendritic 和 Megakaryocyte_platelet 约在 0.27 到 0.36 之间。这个差异提示细胞毒性 marker 在该矩阵中更同向，其他方向需要结合单基因、外部参考或蛋白层信息继续核查。
相关系数不能读成 annotation accuracy，也不能用来计算身份纯度。两个 panel 即使完全不重复，也共同受到同一 donor、同一过滤、同一测序平台和表达稀疏的影响。独立验证需要另一批样本、作者标签、CITE-seq 蛋白、流式或外部参考映射。
cluster 层面的连续程序
随后把程序分数按 Leiden cluster 汇总，可以观察无监督结构与 marker 方向是否大体相容。这里使用的是 cluster 内部连续分数，不发布 marker-derived composition。
不同 cluster 可以呈现 T/NK、B、髓系、树突或血小板相关方向。cluster 中位数受群体大小、表达稀疏和归一化影响，不能换算成 donor A 的生物组成，更不能推广到普通人群。图中行名仍是 Leiden 编号，程序列也仍是连续方向。
这张图适合帮助研究者决定后续子集分析入口。例如某些 cluster 的 cytotoxic T/NK 程序较集中，可以进入 CD8 T 与 NK 的外部参考对照；某些 cluster 的 CD14 或 FCGR3A 程序较集中，可以进入单核细胞内部 marker 检查。下一步分析需重新确定阈值和独立证据，不能沿用最高分结果直接改名。
六张公开图的阅读顺序
QC 图确认矩阵的基本可读性；Leiden UMAP 展示无监督结构；最高分诊断说明程序分离程度；连续分数 UMAP 定位表达方向；held-out 图检查同矩阵一致性；cluster 汇总把这些方向放回计算结构。每张图承担不同任务，不能用一张图替代全部证据。
这条顺序也能降低误读。先看 QC 可避免把低质量尾部当成新群体，先看 Leiden 可避免按 marker 预设所有区域，先看连续分数可避免把 cluster 编号直接写成身份，再结合 marker 一致性决定哪些方向值得继续分析。
与源论文的关系
Zheng et al. 研究展示高通量 droplet 单细胞平台在大规模免疫细胞测量中的能力。本文使用公开 fresh PBMC 68k filtered matrix，核对其今天仍可见的 PBMC 主干表达结构；没有重新做平台建库、原始 reads 处理或完整性能评估。
当前公开图能支持 PBMC 中 T/NK、B、单核、树突和血小板相关连续方向，也能显示大规模矩阵的 QC 与无监督结构。它不能支持疾病机制、治疗反应、临床正常范围或所有 T cell 亚型的精细功能定义。单 donor 是这些结论的主要统计边界。
容易过度解释的地方
大细胞数不等于大生物重复。68,551 个细胞来自一个 donor，细胞级分布只说明该 donor 的观察结构。若没有独立 donor，不能把某类细胞的相对数量写成普通血液的基准。
marker program 也不等于人工注释。NKG7/GNLY/PRF1 同时出现在多种细胞毒性状态中，LYZ、LST1 与抗原呈递相关基因也可能在边界群体共享。血小板相关信号需要考虑真实血小板、附着 RNA 和 ambient RNA。更细的标签需要外部参考和人工复核。
filtered matrix 还限制了上游技术解释。QC 图可以发现异常分布，却不能重建 barcode calling 或分子层错误。任何跨项目比较都应统一基因空间、表达变换、QC 规则和 donor 层级。
可继续推进的分析
T/NK 子集可以在外部参考支持下继续检查 CD4、CD8、NK、naive、memory 和 cytotoxic 方向；monocyte 子集可以比较 CD14、FCGR3A、S100A8/S100A9、LST1 等程序；B cell 与 Dendritic 子集需要结合更多 marker；血小板相关对象应结合 doublet、ambient RNA 和细胞大小复核。
若用于私有 PBMC 项目，应把 donor、样本、处理条件和批次放在统计设计前面。公开 68k 只能提供 marker 面板与图形阅读参考，不能直接充当样本正常范围。差异表达、通路、状态或组成分析也需要在生物重复层面重新建模。
结论
这份 10x filtered matrix 包含 68,551 个 donor A 细胞和 17,788 个工作基因。QC 与 Leiden 图证明矩阵具有可读的无监督结构；四张审计图显示主要免疫程序的相对位置、同矩阵 marker 一致性及 cluster 层连续方向。
当前分析不发布 CD4 T、B cell、monocyte、Dendritic 或 platelet 的离散身份、纯度和比例。它提供的是这份单 donor PBMC 矩阵的结构描述，以及一套可迁移到其他免疫项目的审查顺序：先确认矩阵与统计单位，再看无监督结构，随后用连续 program 和独立来源逐层核对。