复现 Yan et al. 人早期胚胎单细胞数据：从 GSE36552 到阶段结构和 processed RPKM 边界

Yan et al. 的 GSE36552 是人早期胚胎单细胞 RNA-seq 经典数据。它最适合用来讲一个发育数据复现的关键问题：公开 processed RPKM 可以清楚复现 oocyte、zygote、2-cell、4-cell、8-cell、morula、late blastocyst 和 hESC 的阶段结构，也能看到母源 marker、ZGA/cleavage marker、pluripotency 和 blastocyst lineage score 的趋势；但它不能直接回答胚胎活性、临床质量、allele-specific 机制或单个细胞最终命运。

统计单位修订（2026-07-19）： 124 列数据对应公开的逐细胞 expression 文件。GEO sample title 可以恢复 20 个 preimplantation 来源单位：3 个 oocyte、3 个 zygote，以及 2-cell、4-cell、8-cell、morula 和 late blastocyst 的 embryo ID。阶段汇总现已先在来源单位内平均，再比较阶段趋势。hESC 只按 passage 0 和 passage 10 汇总为培养参考；passage 不能当作胚胎或独立生物学重复。每个阶段只有 2 至 3 个来源单位，因此本文不进行总体阶段效应检验。

为什么选这篇文献？

早期胚胎数据很容易被写成“阶段标签贴图”：把每个细胞按 oocyte、zygote、2-cell、4-cell、8-cell、morula、blastocyst 标上颜色，然后说“复现成功”。但对研究项目有价值的不等于贴标签，重点回答更细的问题：阶段变化是否在表达轴上连续？母源转录本下降和胚胎基因激活相关 marker 是否有趋势？blastocyst 内部是否能看到 TE/EPI/PE-like score 的线索？这些线索又能支持到什么程度？

这篇复现把问题限定在公开 RPKM 层面的阶段结构和 marker 趋势审计。类似项目如果只有 processed expression table，可以先整理数据层级、来源单位、可重复的图和结论边界，再判断是否需要 raw-level 分析或额外实验。

论文和数据来源

论文、数据和公开矩阵信息如下。这里先把来源和矩阵层级交代清楚。

公开矩阵进入分析前，先确认数据层级和规模。

复现边界： 本文使用每个 GSM 样本对应的 expression.txt.gz，其中包含 gene-level RPKM 和 unique-read summary。GEO 还提供 BED、TDF 和 26GB 级 RAW.tar，但本文没有做 FASTQ/BED 级重新比对。因此结论限定在 processed RPKM 层面的阶段结构、marker 趋势和 lineage-score 线索。

方法和分析流程

本文的处理顺序从数据层级开始：从 series matrix 提取 124 个样本标题、GSM accession、cell type 描述和 per-cell expression 文件 URL；下载并合并 124 个 expression.txt.gz，构建 gene × cell 的 RPKM 矩阵，同时记录 unique-read total 和 detected genes；从 sample title 恢复 oocyte、zygote 和各阶段 embryo ID，并把 hESC passage 单独记录为培养参考；使用 log2(RPKM+1)、表达过滤、PCA、UMAP 和矩阵状态聚类检查 cell-level structure；涉及阶段均值、signature 和代表基因趋势时，先在同一来源单位内平均，再在阶段内汇总；同时审计 blastocyst lineage-like score、hESC 参考和 processed matrix 边界。

数据规模：124 个单细胞不等于大 atlas，但阶段信息很完整

这份数据包含 124 个公开 per-cell 表达文件，其中 oocyte 3 个、zygote 3 个、2-cell 6 个、4-cell 12 个、8-cell 20 个、morula 16 个、late blastocyst 30 个、hESC 34 个。标题可恢复的来源单位分别为 3、3、3、3、3、2 和 3 个，hESC 则来自 passage 0 与 passage 10。细胞数和阶段跨度适合复查表达结构；阶段间统计仍受每组来源单位很少的限制。

图 1. 左图同时列出各阶段的细胞数和可恢复来源单位数；中图显示每个来源单位包含的细胞数；右图先在来源单位内汇总 detected genes。hESC 的两个 passage 只作为培养参考。不同阶段仅有 2 至 3 个 preimplantation 来源单位，图中趋势不构成总体阶段效应检验。

这张图回答的是来源和比例问题。它适合用来发现样本不平衡、分组偏移或需要子集分析的地方；更强的生物学解释还要结合原文设计和额外证据。

这一步是写发育复现文章的起点。细胞少并不意味着不能分析；关键的是把数据层级讲清楚。processed RPKM 能回答表达模式和阶段趋势，不能替代 raw reads、allele-aware pipeline 或 lineage tracing。

PCA/UMAP：阶段结构能复现出来

在高变基因 PCA 和 UMAP 中，oocyte/zygote/2-cell/4-cell/8-cell、morula、late blastocyst 和 hESC 形成清晰结构。尤其 PCA 中能看到一个明显的发育阶段轴，hESC 则作为参考群体与胚胎细胞分开。

图 2. PCA 和 UMAP 都显示阶段标签具有强表达结构。这个结果支持“公开 RPKM 可复现阶段分层”，但不能把 UMAP 距离解释成真实时间距离或个体细胞命运路径。

低维结构只回答表达空间是否可读。颜色或区域分开说明标签、阶段或状态和表达矩阵存在对应关系；它还不能单独证明谱系方向、空间位置、机制强弱或最终命运。

这张图回答了最基本的问题：公开 per-cell RPKM 表不只有孤立样本，它保留了足够的发育阶段结构，可以作为后续 marker trend 的基础。

阶段相关表达轴：不能把低维连线当作胚胎轨迹

发育数据需要同时看阶段分层和相邻阶段的表达变化。这里先在每个 oocyte、zygote 或 embryo 内计算 PC 均值，再按 stage 展开，并连接 oocyte 至 late blastocyst 的来源单位中位点；hESC 的两个 passage 单独作为培养参考显示。

图 3. 左图每个点代表一个可恢复的 preimplantation 来源单位，纵轴为该单位内细胞的平均 PC1；右图连接各阶段来源单位的中位点。hESC passage 用独立符号标为培养参考，不进入胚胎路径。该图说明阶段相关表达结构，不构成 lineage tracing 或总体阶段效应检验。

低维图只能说明表达空间的相似性。群体分开、阶段相邻或标签聚集，可以支持后续检查 marker 和组成，但不能单独写成谱系方向、空间位置或机制强弱。

PCA axis、来源单位阶段中位点和 marker trend 可以共同说明表达状态随阶段变化。图中已经避免让同一胚胎的多个细胞重复加权，但每个阶段只有 2 至 3 个来源单位，仍不足以建立稳定的总体阶段模型，也不能把相邻阶段写成同一胚胎的实际谱系追踪。

marker heatmap：母源、ZGA、pluripotency 和 blastocyst 线索

阶段结构站住后，下一步是 marker。我们整理了 oocyte/maternal、ZGA/cleavage、pluripotency/EPI、trophectoderm-like、primitive-endoderm-like 和 hESC-like 相关基因。

图 4. ZP1/ZP2/ZP3、GDF9、BMP15、NLRP5 等 oocyte/maternal marker 在早期阶段更突出；ZSCAN4、DPPA2、DPPA4、LEUTX、TPRX1 等 cleavage/ZGA 相关 marker 在中间阶段出现；POU5F1、NANOG、SOX2、LIN28A、UTF1、DPPA5 以及 GATA3/CDX2/KRT8/GATA6/SOX17 等帮助解释 blastocyst 和 hESC 相关趋势。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这个图适合展示复现深度：不只放一张 UMAP，要把关键 marker 放回阶段结构中，说明每个阶段为什么可解释。

signature 层面：趋势比单基因更稳

单个基因在 single-cell RNA-seq 中可能出现检测不稳定，因此 signature score 通常比单 gene 更适合做阶段趋势概览。

图 5. Oocyte/maternal、ZGA/cleavage、Pluripotency/EPI、Trophectoderm-like、Primitive-endoderm-like 和 hESC-like signatures 先在来源单位或 hESC passage 内平均，再按阶段展示。这里的 score 用于趋势审计，不是细胞命运分类器。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

写这张图时必须克制。比如 late blastocyst 内部出现 TE-like 或 PE-like score 差异，只能说是 lineage-like expression clue，不能直接给每个细胞判定最终谱系。

代表基因趋势：把阶段变化讲具体

为了让阶段轴不只是抽象 PCA，我们选取 ZP3、NLRP5、DPPA4、POU5F1、NANOG、GATA6、GATA3、KRT8、SOX17 等代表基因，画出每个阶段的单细胞分布和均值趋势。

图 6. Oocyte/maternal marker 在早期阶段更高，pluripotency 和 blastocyst 相关 marker 在后续阶段更突出。每个点代表一个可恢复来源单位或 hESC passage 的平均 log2(RPKM+1)，黑线表示这些单位的阶段均值。图中不再把同一胚胎内的多个细胞当作独立重复。

marker 和 score 要成组解释。单个基因高表达只能提供线索；只有 dotplot、heatmap、signature、metadata 和组成结果互相支持，才适合写成细胞身份或状态判断。

这类图对复现文章需要先确认，因为它直接回答“为什么说阶段结构可信”。如果只有 PCA，读者可能觉得是降维效果；加上 marker trend，阶段解释才更完整。

blastocyst lineage score：能看线索，但不能硬判谱系

GSE36552 的 sample metadata 对 late blastocyst 细胞没有直接给出 TE/EPI/PE 明确标签，因此本文不把 late blastocyst 细胞硬标成三类。我们只用 TE-like、EPI-like 和 PE-like score 做探索性视图。

图 7. Late blastocyst 细胞在 EPI-like、TE-like 和 PE-like score 维度上存在分散，提示内部可能有 lineage-like 表达差异。但因为 metadata 没有明确 lineage 标签，本图只能作为探索性线索，不能直接作为细胞命运判定。

这类图要按成组证据来读。单个基因或局部高表达只能提供线索，只有 marker panel、signature score、metadata 和组成信息互相支持时，才适合写成细胞身份、状态或谱系倾向。

这说明严肃写作和泛泛复现的区别。为了吸引读者，当然可以说“blastocyst 内部有分化线索”；但为了负责，必须同时说清楚：这是 processed RPKM + score 层面的线索，不等于最终谱系标签。

hESC reference：参考对照，不等于 derivation 重建

原文还包含 hESC 样本。本文把 hESC 作为 reference，观察它和 preimplantation embryo cells 在 PCA 和 hESC-like score 上的关系。

图 8. 左图保留 cell-level PCA 结构；右图按 preimplantation 来源单位或 hESC passage 汇总 hESC-like score。hESC 只用于比较培养参考与胚胎阶段的表达状态，不能据此重建 ESC derivation 过程或胚胎细胞的最终命运。

这里的重点是限制结论强度。公开矩阵能支持表达结构、marker 和 metadata 层面的复核；更强的机制、空间、功能或临床判断，需要 raw reads、原文模型、空间/病理信息或实验验证继续补证据。

对类似项目来说，这种 reference 处理很实用。参考群体可以帮助解释表达方向，但不能因为参考群体在图上靠近某个阶段，就直接写成来源关系或命运决定。

矩阵状态和文件层级：别忘了 processed matrix 边界

为了补充文件层级，我们同时展示了矩阵状态和表达文件大小分布。这里不等于为了评价哪个样本好坏；提示公开输入是 per-cell expression file，不等于统一 raw count matrix。

图 9. 左图的 matrix state 是 cell-level 描述；右图先按来源单位或 hESC passage 汇总 per-cell 表达文件大小。这些技术信息提醒我们，输入是一组 processed expression files，不能写成 FASTQ 级重跑或 allele-specific 分析。

这个边界尤其重要。GEO 提供 BED、TDF 和 RAW.tar，但本文没有下载并重跑 26GB 级原始数据；如果要回答 allele-specific、isoform、read alignment 或 mutation/variant 层面问题，需要另做 raw-level 分析。

复现边界：哪些能说，哪些不能说

图 10. 本文支持 124 个 per-cell expression files 的阶段结构、marker 趋势和探索性 lineage score；但不支持胚胎活性/临床质量、allele-specific 或 isoform 机制、以及单个细胞最终命运判定。

这里的重点是限制结论强度。公开矩阵能支持表达结构、marker 和 metadata 层面的复核；更强的机制、空间、功能或临床判断，需要 raw reads、原文模型、空间/病理信息或实验验证继续补证据。

这张图是文章最重要的质量控制。早期胚胎题材很容易被写得很大，但公开 processed RPKM 能支持的是表达层面的复现和线索整理，而不等于临床或机制定论。

与源论文主线的对照

本次复现与源论文主线一致的地方包括三点。

第一，公开 per-cell expression files 可以复现人早期胚胎从 oocyte/zygote 到 cleavage、morula、late blastocyst 的强阶段结构；hESC 作为培养参考。来源单位聚合后的 PC1、signature 和代表基因趋势仍保留阶段方向，说明结果不是由同一胚胎内细胞数较多单独造成。

第二，关键 marker 趋势可读。母源/oocyte marker、ZGA/cleavage marker、pluripotency marker、TE-like 和 PE-like marker 在 stage mean 和单细胞趋势图中都有对应变化，说明公开 RPKM 表保留了发育表达信号。

第三，复现也显示了边界。metadata 没有给 late blastocyst 的明确 TE/EPI/PE 标签，因此本文只做 lineage-like score 线索；没有 raw reads/allele-aware pipeline，因此不讨论 allele-specific 或机制层面的原文扩展结论；没有 lineage tracing，因此不判定个体细胞命运。

深度解读：证据链和解释边界

回答范围：在不重跑 26GB raw tar 和 BED 文件的情况下，公开 per-cell RPKM 表是否仍能支持严肃的早期胚胎阶段复现。答案是可以，前提是把结论限定在 processed expression 层级。

raw / processed matrix 边界：本文输入是 expression.txt.gz，每个样本有 gene-level RPKM 和 unique-read summary。它适合做阶段结构、marker trend、signature score 和 hESC reference 对照；不适合直接回答 raw-read alignment、allele-specific expression、isoform usage 或 embryo viability。

关键图读法：图 1 是样本和输入层级；图 2 是阶段结构；图 3 是胚胎阶段相关 PC1 轴和独立 hESC 参考；图 4 是 marker heatmap；图 5 是 signature score；图 6 是代表基因趋势；图 7 是 blastocyst lineage-like clue；图 8 是 hESC reference；图 9 是矩阵状态和文件层级；图 10 是结论边界。

不能过度解释的部分：不能把 PC/UMAP 连续性写成真实发育命运，不能把 late blastocyst score 直接写成明确 lineage 标签，不能把 hESC reference 和 embryo stage 的距离写成 derivation 关系，不能从 processed RPKM 推出临床胚胎质量或活性。

继续深入的下一步：可以下载并处理 raw/BED 层数据做更严格的 reads-level 验证；可以结合外部早期胚胎 atlas 做 marker 交叉检查；可以针对 late blastocyst 做更细的 TE/EPI/PE signature 与 source paper 对照；也可以把这套流程用于旧胚胎或发育单细胞项目的阶段重注释和结果图重做。

对类似项目有什么启发？

这篇数据说明，发育单细胞复现最有价值的不能把每个阶段重新画一遍，要把阶段轴、marker 趋势、连续性证据和解释边界合在一起。很多旧项目只有 processed expression table，也完全可以先做这种层级清晰的复现：哪些图能支持阶段结构，哪些 marker 能解释变化，哪些结论需要 raw-level 或实验验证。

• 痛点 2：processed RPKM 可以支持阶段结构，但不能支持 raw-read 机制结论。
• 痛点 3：blastocyst lineage score 是线索，不等于没有标签时的硬分类。
• 痛点 4：hESC reference 有助于解释 pluripotency-like 状态，但不等于命运追踪。

小结

Yan et al. GSE36552 的公开 per-cell expression files 可以复现人早期胚胎的主要阶段结构：124 个逐细胞样本、20,286 个 gene union、16,962 个过滤后基因，覆盖 oocyte、zygote、2-cell、4-cell、8-cell、morula、late blastocyst 和 hESC。标题可恢复 20 个 preimplantation 来源单位；来源单位聚合后的 PC1、marker、signature 和代表基因趋势共同支持 processed RPKM 层面的阶段相关表达变化。hESC 的两个 passage 只作培养参考。

但这篇复现的关键不等于“阶段分得开”，要把边界说清：阶段结构是表达证据，lineage score 是探索性线索，hESC 是参考对照；胚胎活性、临床质量、allele-specific 机制、isoform 变化和单细胞命运判定，都需要更强数据和实验支持。对类似发育单细胞项目来说，这种复现可以把旧数据整理成可复查的图、marker 解释和后续分析问题。