这是一篇围绕 MacParland et al. 人肝脏单细胞图谱的深度复现记录。重点不在重新放一张 UMAP；更需要说明的是，公开 processed expression matrix、CellClusterType 注释、样本组成、hepatocyte 分层、LSEC/portal endothelial、Kupffer/髓系、淋巴和星状细胞证据能否互相对上，以及 processed matrix 在空间生态位和机制问题上会止步在哪里。
图表追溯修订（2026-07-19）： 原 hepatocyte-LSEC 图由每个作者 cell-type label 的平均 hepatocyte signature 与平均 LSEC/endothelial signature 构成。图已重画并改称“cell-type mean expression contrast”，不再解释为单细胞连续轴、zonation 或空间梯度。独立 manifest 记录输入表、修复脚本和输出图哈希。
论文和数据来源
论文、数据和公开矩阵信息如下。这里先把来源和矩阵层级交代清楚。
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 论文 | MacParland et al. Nature Communications, 2018 |
| 论文题名 | Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations |
| DOI | 10.1038/s41467-018-06318-7 |
| 公开数据 | GSE115469 |
| 公开矩阵 | processed expression matrix |
| 注释文件 | CellClusterType |
这篇论文的经典价值来自，它把 human liver atlas 与肝内巨噬细胞异质性放在同一组单细胞数据里讨论。对复现来说，它同时包含实质细胞、胆管细胞、肝窦内皮、门管区内皮、T/NK/B/plasma、炎症性和非炎症性 macrophage、星状细胞等多个层级，既适合做细胞身份复核，也适合讨论公开矩阵的解释边界。
本文使用 GEO 公开的 processed expression matrix 和 CellClusterType 注释表。也就是说，本次复现不等于 FASTQ 层面的重新比对，不重建 read-level QC、比对参数、doublet 处理或所有原文实验验证；重点是检查公开矩阵层面是否能够恢复主要肝脏细胞结构和 marker/signature 方向。
这一步对 MacParland 数据尤其重要。GSE115469_Data.csv.gz 和 GSE115469_CellClusterType.txt.gz 是两类文件：前者给表达矩阵，后者给逐细胞注释。复现时需要先用细胞名把两者对齐，再确认 Sample、Cluster、CellType 是否完整。只要这一步出现错位，后面看起来再漂亮的 UMAP 都会失去解释意义，因为颜色和表达值可能已经不是同一批细胞。
公开数据还带来一个常见误区：CellClusterType 里的标签看起来已经很细，似乎可以直接拿来写结论。严肃复现不能这么做。标签只是入口，必须回到表达矩阵检查 ALB/APOA1/TTR、PECAM1/VWF/STAB2、LST1/C1QA/CD68/MARCO、CD3D/NKG7、MS4A1/CD79A、COL1A1/DCN/RGS5 等成组 marker 是否支持这些标签。只有标签、marker、样本组成和 signature 方向互相一致，文章里的细胞身份判断才站得住。
为什么这篇需要做加深分析？
MacParland 这组数据很容易被简化成“人肝脏 UMAP”。但如果只看一张降维图，至少会丢掉四类关键信息。
第一，肝脏组织本身高度结构化。hepatocyte、LSEC、portal endothelial、cholangiocyte 和 stellate cell 不只是不同细胞类型，也和肝小叶分区、血管结构和胆管结构有关。公开矩阵能看到转录特征，但不能直接替代空间定位。
第二，源论文标题强调 intrahepatic macrophage populations。复现时不能只把 macrophage 当成一个灰色背景群体，而要检查 inflammatory / non-inflammatory macrophage 是否有髓系/Kupffer 相关表达证据。
第三，样本组成会影响解释。如果某个 compartment 在某个样本中占比很高，后续 signature 或 marker 解释就必须保留 sample context。
第四，processed matrix 可以支持细胞身份、组成、signature 和可视化复核，但不能单独支持门静脉/中央静脉区域差异、空间生态位、细胞互作方向或机制因果结论。
所以这篇深度复现要把问题从“能不能重画图谱”推进到三组更具体的判断。公开矩阵能不能支撑 hepatocyte、cholangiocyte、LSEC/portal endothelial、macrophage、lymphoid、stellate 等主要身份？样本组成会不会影响我们对 macrophage 和内皮相关信号的解释？当图上出现 hepatocyte zonation、LSEC 或 Kupffer 相关字眼时，哪些可以写成表达层面的复核，哪些必须保留为空间或机制验证问题？
这三组判断对应不同的证据。细胞身份要看 marker dotplot 和 signature heatmap；样本影响要看 sample UMAP、sample composition 和 compartment heatmap；空间与机制边界要看数据层级。MacParland 数据可以把这些证据串起来，但不能用 processed matrix 越过它没有提供的信息。
本次深度复现方法与流程
本文的处理顺序从数据层级开始：从 GEO 读取 processed expression matrix 和逐细胞 CellClusterType 注释表；按 CellName 对齐表达矩阵与 metadata，保留 Sample、Cluster 和 CellType 标签；复核细胞规模、基因规模、样本数量、源注释细胞类型数量和基础组成；保留基础复现中的 UMAP、sample 分布、细胞类型组成、样本组成、marker dotplot 和 signature UMAP；把 20 个细胞类型进一步归纳成 hepatocyte、endothelial/LSEC、macrophage/Kupffer、lymphoid/B-lineage、cholangiocyte、stellate 和 erythroid 等 compartment；新增 compartment-level composition、sample-level compartment heatmap、cell type-level signature heatmap 和 cell-type mean expression contrast；把结果逐项和源论文主线、公开 processed matrix 边界进行对照。
数据规模和组成概览
公开矩阵进入分析前，先确认数据层级和规模。
| 项目 | 数值 |
|---|---|
| cells retained | 8,444 |
| genes after filter | 19,984 |
| sample labels | 5 |
| annotated cell types | 20 |
| hepatocyte-labeled cells | 3,501 |
| macrophage-labeled cells | 1,192 |
图 1. 按源注释细胞类型标记的 UMAP。Hepatocyte 1-6、LSEC/portal endothelial、cholangiocyte、macrophage、T/NK/B/plasma 和 stellate cell 等群体形成可解释结构。
总体图先回答一个基础问题：公开矩阵是否还能恢复人肝脏主要细胞生态？答案是可以。肝细胞相关亚群、内皮/LSEC 相关群体、免疫细胞和低丰度胆管/星状细胞不等于随机混在一起；它形成相对清晰的表达空间。这个结果说明表达矩阵与 CellClusterType 注释表对齐正常，可以继续做 marker 和 signature 复核。
这张图还给后面的文章定了阅读顺序。MacParland 数据里的标签很多，如果直接逐个解释 Hepatocyte 1-6、LSEC 1-3、inflammatory macrophage、non-inflammatory macrophage、plasma cell、mature B cell、hepatic stellate cell，读者很容易只记住颜色很多。更好的读法是先把它们放回肝脏组织结构：实质细胞是一条线，内皮/LSEC 是一条线，免疫/Kupffer 是一条线，胆管和星状细胞是低丰度但生物学含义很强的线。
UMAP 只能说明转录相似性。它不能告诉我们某个 LSEC 群体在肝小叶的精确位置，也不能告诉我们某类 macrophage 与某类 hepatocyte 在组织中直接接触。图 1 的作用是建立可复核的图谱入口，后续所有更强的解释都要再加一层证据。
sample effect：先看来源，再讲状态
图 2. 按样本编号标记的 UMAP。不同样本在部分区域并不完全均匀混合，提示解释细胞组成、亚群和 signature 时必须保留 sample metadata。
肝脏公开数据常常带有取材、消化、捕获和 donor 背景差异。图 2 不用于否定数据质量；它提醒我们不要把所有表达差异都直接写成普遍生物学规律。如果某些细胞群主要来自少数样本，那么 composition 和 score 需要在样本层面再次检查。
这类 sample effect 在肝脏数据里尤其容易被忽略。肝实质细胞体积大，组织消化和捕获对不同细胞类型的影响不完全相同；免疫细胞、内皮细胞和胆管/星状细胞的比例也可能受取材区域和样本处理影响。图 2 不能给出这些因素的具体来源，但它能提醒读者：后面的 signature 如果在某个区域很高，要先问它是不是由某个样本或某个 compartment 主导。
图 3. 各样本内源注释细胞类型比例。部分样本中 hepatocyte、LSEC、plasma/lymphoid 或 macrophage 的比例明显不同。
这个图是后续解释的背景板。比如某个样本如果 plasma cell 或某一类 hepatocyte 占比较高，整体 UMAP 和 signature 可能都会受影响。严肃复现不只追求降维图好看；需要把 sample composition 放在读者眼前。
图 3 也能解释为什么本文不把全部 cell type 逐一写成同等强度的结论。细胞数多、跨样本都能看到、marker 成组清楚的群体，可以承担更强的复现判断；低丰度或样本偏倚明显的群体，更适合作为图谱组成的一部分来描述。这样写不会削弱文章，反而能让读者看清哪些结果稳，哪些结果只是后续分析入口。
先按大 compartment 读图
图 4. 将 20 个源注释细胞类型归并为主要肝脏 compartment 后的细胞数。Hepatocyte、endothelial/LSEC、macrophage/Kupffer 和 lymphoid/B-lineage 构成本次复现的主要结构。
把 20 个细胞类型压缩成 compartment 有两个好处。第一，它让读者先看到组织层级，而不等于被长标签列表淹没。第二，它能避免把每个细胞类型都过度解释成独立机制。对肝脏图谱来说，先分清实质细胞、血管内皮、免疫细胞、胆管和星状细胞，是后续讨论分区和微环境的前提。
compartment 视角还有一个用途：它把“复现”和“再分析”连接起来。只要 hepatocyte、endothelial/LSEC、macrophage/Kupffer、lymphoid/B-lineage 等大类能够稳定恢复，后续才有必要进入更细层级，比如 hepatocyte zonation、LSEC 亚型、macrophage 状态或淋巴细胞组成。若大 compartment 本身都混乱，继续拆亚群只会制造看似精细的噪音。
图 5. sample-level compartment fraction heatmap。它把各样本中的 hepatocyte、endothelial/LSEC、macrophage/Kupffer、lymphoid/B-lineage 等比例压缩到一个可比较视图中。
这个 heatmap 的价值来自把“样本差异”从 UMAP 里拎出来。某些样本更偏 hepatocyte-rich，某些样本更偏 endothelial/immune-rich。后续如果讨论 macrophage 或 LSEC 特征，不能只看总体均值，还要考虑这些群体在不同样本中的比例。
图 5 适合和图 3 对照。图 3 保留了源注释 cell type 的细节，图 5 则把标签合并成组织层级。两者如果方向一致，说明样本组成差异不只是某个长标签造成的视觉误差，已经落在 hepatocyte、endothelial/LSEC、macrophage/Kupffer 等大 compartment 上。这个信息会影响后续所有 signature 的解释强度。
在项目分析中，这一步通常决定是否需要做 patient/donor-aware 的统计。本文是公开复现，不把它扩展成正式模型；但如果要继续研究 macrophage 或 LSEC 差异，下一步应按 sample 或 donor 汇总，而不是把所有细胞直接混在一起比较。
marker 证据：标签不只靠 metadata
图 6. 经典肝脏 marker dotplot。ALB/APOA1/TTR/CYP3A4 支持 hepatocyte，KRT19/EPCAM/SOX9 支持 cholangiocyte，PECAM1/VWF/STAB2/CLEC4G 支持 endothelial/LSEC，LST1/C1QA/CD68/MARCO 支持髓系/Kupffer 方向，CD3D/NKG7/MS4A1/CD79A 支持淋巴/B 细胞，COL1A1/DCN/RGS5 支持星状/基质方向。
marker dotplot 是这篇复现最重要的证据之一。CellClusterType 提供了标签，但标签必须由表达支持。对于人肝脏数据，如果 hepatocyte 区域没有 ALB、APOA1、TTR 等表达，或者内皮群体没有 PECAM1/VWF/STAB2，后续所有解释都站不住。当前 marker 图与主要注释方向一致，说明公开矩阵足以支持细胞身份层面的复核。
这张图还可以帮助识别解释边界。ALB、APOA1、TTR 支持 hepatocyte 主体身份，但不能单独完成 Hepatocyte 1-6 的功能排序；PECAM1、VWF、STAB2、CLEC4G 支持 endothelial/LSEC 方向，但不能直接给出空间位置；LST1、C1QA、CD68、MARCO 支持 macrophage/Kupffer 方向，但不能替代原文的功能实验。marker 证据越具体，结论也越要对应到它能支撑的层级。
肝细胞和 LSEC：可以看见分层，但不能替代空间定位
图 7. Hepatocyte signature 在 UMAP 上的分布。肝细胞相关区域呈现更高评分，支持 hepatocyte 1-6 的主体身份。
图 7 把肝细胞程序投回全体细胞空间，用来补足 marker dotplot 的视角。hepatocyte signature 高分区域如果与 Hepatocyte 1-6 的 UMAP 区域重合，说明注释和表达程序相互支持；若高分散在免疫或内皮区域，就需要怀疑归一化、基因集或标签对齐。当前结果支持 hepatocyte 主体结构，但对 hepatocyte 内部更细的分区仍要保持克制。
肝细胞亚群经常和 zonation 一起讨论。这里可以说公开矩阵中存在 hepatocyte 相关表达分层，也可以把它作为 zonation 复核的入口；但不能把二维 UMAP 上的距离直接写成小叶空间位置。要把 Hepatocyte 1-6 放到 periportal 或 pericentral 语境里，还需要更细的 zonation marker 对照和空间/组织学证据。
图 8. LSEC/endothelial signature 在 UMAP 上的分布。STAB2、CLEC4G、PECAM1、VWF 等基因帮助识别肝窦/内皮相关区域。
这两张图适合一起读。hepatocyte signature 回答的是“哪些区域主要是肝实质细胞”，LSEC/endothelial signature 回答的是“内皮和肝窦相关区域是否可见”。但它们不能单独证明空间生态位。比如 periportal 和 central venous LSEC 这些标签具有空间含义，processed matrix 可以复核相应表达方向，却不能替代空间转录组、组织切片、免疫染色或原文定位实验。
LSEC/endothelial signature 的解释还要和普通内皮 marker 区分开。PECAM1、VWF 能支持内皮身份，STAB2、CLEC4G 等更贴近肝窦内皮特征。若只看一个泛内皮 score，可能会把 portal endothelial 和 LSEC 的差异压平；若只看一个 LSEC marker，又可能受单基因检测不稳定影响。因此本文把 dotplot、signature UMAP 和后面的 cell type-level heatmap 放在同一条证据链里读。
图 9. 每个点代表一个作者 cell-type label，横纵坐标分别是该标签的平均 hepatocyte signature 和平均 LSEC/endothelial signature。点大小表示细胞数，颜色表示大 compartment。该图只比较类别均值，不表示单细胞连续性、肝小叶 zonation 或空间坐标。
这个类别均值对照可以解释复现到了哪一层。某个标签的 hepatocyte signature 较高，说明作者标签与肝实质表达程序相容；LSEC/endothelial signature 较高则支持内皮方向。它不能证明 portal/central venous 的真实空间位置，也不能把标签间连成转分化路径。
图 9 的好处是把“看起来相邻”换成“两个 signature 轴上的相对位置”。这对报告很有用，因为读者可以一眼看到哪些 cell type 落在 hepatocyte 方向，哪些落在 endothelial/LSEC 方向，哪些只是中间或低分群体。它也能避免一个常见错误：把 UMAP 上靠近的点直接解释成细胞互作或空间邻近。这里的距离仍是表达空间距离，不是组织距离。
Kupffer/髓系与免疫背景
图 10. Kupffer/myeloid signature 在 UMAP 上的分布。LST1、C1QA、C1QB、CD68、MARCO、LYZ 等基因支持 inflammatory 和 non-inflammatory macrophage 相关区域。
源论文标题强调 intrahepatic macrophage populations，因此 macrophage 不能只作为背景细胞处理。公开矩阵中，inflammatory macrophage 和 non-inflammatory macrophage 相关区域能被髓系/Kupffer signature 支持，这是与原文主线一致的部分。
不过，复现边界也必须写清楚。单靠 processed expression matrix 和一组 signature，不能重做原文全部 macrophage 功能实验，也不能判断巨噬细胞状态的因果来源。它能支持的是：公开矩阵中存在可识别的髓系/Kupffer 相关表达结构，并且这些结构与注释相符。
如果把这篇文章做成项目级深挖，macrophage 是最值得继续投入的部分。可以先把 macrophage/Kupffer 相关细胞单独取出，重新做邻域图、marker、sample composition 和 inflammatory/non-inflammatory score；再看 C1QA/C1QB、MARCO、LYZ、S100A8/S100A9、FCGR3A 等基因是否形成稳定组合。只有在子集内证据足够清楚时，才适合把 macrophage 状态写成更细的生物学问题。
signature heatmap：哪些标签由哪些程序支撑？
图 11. hepatocyte、cholangiocyte、LSEC/endothelial、myeloid/Kupffer、lymphoid 和 stellate signature 在 20 个细胞类型中的平均评分。这个图用于检查标签和 signature 是否交叉支持。
signature heatmap 把多个 marker 程序放在同一张图里。理想情况下，hepatocyte 标签应在 hepatocyte signature 上更高；LSEC/portal endothelial 应在 endothelial/LSEC signature 上更高；macrophage 应在 myeloid/Kupffer signature 上更高；hepatic stellate cell 应在 stellate signature 上更高。当前结果总体符合这个方向。
这类图也提醒我们，不要把 signature 误读成单一细胞类型的专属开关。比如某些 ECM 或炎症相关基因可能在多个群体中有背景表达，某些低丰度群体也可能因为细胞数少而均值不稳定。因此 heatmap 的作用是增加证据，而不等于替代逐基因 marker 和样本层面的检查。
图 11 还能帮助发现“看似合理但需要复核”的地方。若一个低丰度细胞类型在多个 signature 上都有中等分数，可能是生物学过渡，也可能是 cell number 太少、背景表达或标签混合。公开文章里不应该把这种结果写成新发现；更稳妥的处理，是把它标记为后续子集分析的入口。这样读者能看到分析深度，也能看到结论边界。
与源论文主线的对照
本次深度复现与源论文主线一致的地方包括：公开矩阵可以恢复 human liver atlas 的主要细胞类型；hepatocyte、LSEC/portal endothelial、cholangiocyte、T/NK/B/plasma、macrophage 和 stellate cell 在表达空间中有清晰结构；inflammatory 与 non-inflammatory macrophage 相关区域能被髓系/Kupffer marker 支持；sample-level composition 对解释结果需要先确认。
没有完成的部分同样需要明确。第一，没有 raw reads，因此没有 FASTQ 级重新比对和 read-level QC。第二，没有重做原文全部 macrophage 功能实验和组织定位验证。第三，没有用空间转录组或组织切片确认 periportal / central venous 区域。第四，没有把 signature score 写成细胞互作或疾病机制结论。
这个对照不只是免责声明。它决定了文章应该怎样下结论：公开矩阵足以支持“主要肝脏细胞类型可复核、macrophage/Kupffer 方向可见、sample composition 需要控制”这些判断；它不足以支持“空间生态位已经被重新证明、细胞互作方向已经确定、某个巨噬细胞状态具有因果功能”这些判断。把两类结论分开，读者才能知道这篇复现可以直接复用到报告中的哪一部分，也知道哪里需要新的实验或更深分析。
与很多浅层复现相比，MacParland 这篇更适合展示“公开数据重用的上限和下限”。上限是：只要矩阵、metadata 和 marker 可靠，公开数据可以被整理成一条清晰的组织图谱证据链。下限是：一旦问题进入空间、功能、互作和因果，processed matrix 就只能提供线索，不能替代原文实验设计。
processed matrix 会丢失什么信息？
很多公开复现会遇到一个问题：为什么用 processed matrix 还能复现图谱，却又不能下太多机制结论？关键在于 processed matrix 通常已经经过作者或数据发布方的上游处理。它保留了表达矩阵和注释信息，但会弱化或移除一部分上游决策痕迹。
在这篇人肝数据里，processed matrix 支持我们检查 cell type、marker 和 signature；但它不直接告诉我们每个 read 如何比对、低质量细胞如何过滤、doublet 如何处理、不同样本如何批次校正，也不能提供组织切片中的真实空间坐标。因此，复现文章可以严肃地说“公开矩阵支持 hepatocyte/LSEC/macrophage 等结构可见”，但不能说“仅凭 processed matrix 证明了门静脉/中央静脉生态位差异的完整机制”。
这也是公开复现需要保持克制的地方：矩阵层面能复核表达证据，空间和机制层面需要原文实验、空间数据或新的验证设计。
在实际项目里，这个边界会直接影响交付策略。客户如果只需要把一个旧公开数据整理成可读报告，processed matrix 足够完成图谱、marker、composition 和 signature 复核；如果目标是写机制故事或提出新的空间互作假设，就要增加原始数据处理、子集重分析、外部数据映射、空间图像或实验验证。两类目标不能混在同一篇文章里，否则读者会分不清哪些结论来自矩阵，哪些只是下一步设想。
深度解读：这篇复现应该怎么读？
这篇复现回答了什么？
它回答的是：在 GEO 公开 processed matrix 和 CellClusterType 注释的基础上，MacParland 人肝脏单细胞数据的主要细胞结构是否能被重新整理、可视化和 marker/signature 复核。答案是可以。hepatocyte、LSEC/endothelial、macrophage/Kupffer、lymphoid/B-lineage、cholangiocyte 和 stellate cell 都有相应表达证据。
raw / processed matrix 的边界在哪里？
processed matrix 适合做图谱复核、细胞类型检查、样本组成、marker dotplot 和探索性 signature score。它不适合声称重做了原始测序比对、完整 QC 决策、空间定位实验或机制验证。尤其是肝脏这种强空间结构组织，processed matrix 不能替代空间证据。
主图应该按什么顺序读？
UMAP 先看主要 compartment 是否可分；sample UMAP 和 sample composition 用来检查样本影响；marker dotplot 是细胞身份的底层证据；signature UMAP 和 heatmap 用来判断表达程序方向；cell-type mean contrast 用于比较实质细胞与内皮/LSEC 标签的平均表达程序。
哪些地方不能过度解释？
不能把 periportal / central venous 标签直接等同于本次复现重新证明了空间位置；不能把 macrophage signature 直接写成完整功能状态；不能把样本组成差异当成普遍组织比例；不能从 processed matrix 推导细胞互作方向或因果机制。
如果继续深入，下一步做什么？
下一步可以在 macrophage 内部单独重聚类，复核 inflammatory 和 non-inflammatory 相关 marker；可以把 hepatocyte 1-6 与已知 zonation marker 做更细对照；可以加入空间或组织定位证据；也可以把这个数据与疾病肝脏数据做参考映射，但这些都应该作为新的分析问题，而不等于从当前图谱直接外推。
如果按优先级排，macrophage 子集应放在前面，因为它与源论文题名和主线最接近；hepatocyte zonation 和 LSEC 分层适合放在第二层，因为它们需要更精细的 marker 和空间解释；跨数据映射适合在图谱复核完成后再做，用于比较疾病肝脏、肝癌或炎症背景下的细胞状态变化。这样的顺序能避免在证据还没有铺稳时过早进入机制叙事。
小结
MacParland 人肝脏数据是一组非常适合训练“严肃复现边界”的经典单细胞资料。它的公开矩阵足以恢复主要 human liver atlas 结构，也能用 marker 和 signature 支持 hepatocyte、LSEC/endothelial、Kupffer/髓系、淋巴和星状细胞等主要身份。与此同时，肝脏的空间生态位、门静脉/中央静脉区域差异、巨噬细胞机制和细胞互作方向，都不能只靠 processed matrix 下结论。一个可信的复现案例，应该同时展示能复现什么，也清楚写出不能过度解释什么。