从20.8万个细胞到患者级证据：Kim等LUAD单细胞图谱的严谨复现

一张单细胞图谱可以同时放下几十个样本、几十万细胞和成千上万的基因。图画完以后，还要核对统计设计：跨部位差异由多少位患者支持，细胞层面的显著性能否上升到人群层面，以及把正常肺、原发肿瘤、淋巴结和脑转移放在一起时，数据究竟提供了部位比较，还是提供了转移时间轴。

Kim 等人在 2020 年发表的 LUAD 图谱，正好把这些问题集中到一个公开数据集中。原研究从 44 位患者的 58 个样本中整理出 208,506 个细胞，讨论了免疫和基质重塑、恶性细胞状态以及转移相关的分子差异。我们重新读取公开的 post-author-QC raw UMI 矩阵和作者 annotation，把患者/样本放回统计设计的中心，逐图检查原文主张在公开数据中能保留到哪一层。

这篇复现得到的结论有清楚的层次：10 对 nLung–tLung 患者的免疫组成变化在经验 logit 配对分析下得到支持；作者 broad labels 得到与作者 marker 列表不重叠的同 assay 留出面板支持；tS2 可以作为稳定的表达程序重现，但跨部位样本比较没有支持它普遍随进展增加；malignant-site 的细胞级差异与患者级 pseudobulk 只有中等方向一致。RNA expression-CNV 结果可以作为交叉拟合后的 pipeline sanity check，不能改称 DNA CNV 或独立恶性标签验证。

论文和数据来源

论文正文、GEO Feature Summary 和 Supplementary Data 1 的样本映射共同提供了来源核对依据。患者 ID 来自元数据字段，未从 barcode、文件名或样本后缀推断。原论文使用了更广的分析链，包括 Monocle 2 轨迹、CellPhoneDB、TCGA 生存分析和 WES 支持的 CNV 解释；本文只讨论公开 GSE131907 矩阵能够直接支撑的再分析层。

这份数据最难回答的三个问题

解剖部位能不能当作疾病进展顺序？

样本的 origin 是 nLung、tLung、tL/B、nLN、mLN、PE 或 mBrain。它描述采样部位，不能自动提供采样时间。10 位患者有 nLung–tLung 配对，3 位患者有 mLN–PE 配对，1 位患者有 tL/B–PE 配对；mLN 与 nLN 的比较来自不同患者。这个结构允许某些配对检验，也明确限制了纵向叙事的范围。

细胞数量很大，统计单位应该放在哪里？

单个细胞可以展示表达分布、群体结构和作者标签的一致性。比例差异、pseudobulk 和 site-level 结果回到样本或患者。若把 208,506 个细胞都当作独立重复，患者间差异会被细胞数量放大，原论文 cell-level p 值也会显得比患者级证据更稳定。

原始矩阵到底有多“原始”？

这里的 raw 指公开矩阵中的 UMI counts，不指未经筛选的测序液滴。公开对象已经经过作者的保留步骤；我们能审计这 208,506 个细胞的 QC 范围，不能恢复 GEO 提交前被排除的液滴、空液滴判断、ambient RNA 处理或原始 read mapping。

数据规模与统计设计

矩阵包含 29,634 个基因 × 208,506 个细胞；计算对象按 cells × genes 存储，即 208,506 × 29,634，非零条目 331,860,266，稀疏密度约 5.3709%。58 个样本映射到 44 位患者。按解剖来源汇总的样本数和公开细胞数如下：

这张表中的细胞数是公开保留矩阵的分母。作者报告的 malignant cell 分母属于另一个筛选层：tLung 6,352、tL/B 6,400、mLN 2,961、mBrain 15,423。后文会把这两个层级分开写。

主要统计约定如下：

• 细胞用于描述性观察；样本或患者是生物学重复；
• nLung–tLung 的组成和 broad pseudobulk 使用 10 位有两侧样本的患者；
• malignant-site pseudobulk 需要每个样本至少 50 个 malignant cells，再按患者比较；
• 图构建允许 sample-balanced 抽样，定量推断仍使用全体符合条件的样本/患者；
• 作者的 cell labels 被视为来源 metadata，不把本分析解释出的 cluster 改写成作者 taxonomy；
• broad/subtype 分析保留 broad cell type 与 subtype 的双层键，避免同名 subtype 跨谱系混合。

分析流程：从 UMI 到患者级比较

原始 UMI counts 先按细胞文库大小归一化到 10,000，再做 log1p。HVG 选择在 sample-balanced training set 上完成，使用 3,000 个高变基因，并从排序中排除线粒体、核糖体和血红蛋白基因。PCA 在每样本最多 500 个细胞的平衡训练集上拟合 50 个 PC，随后投影全部细胞。UMAP 和 Leiden 只在每样本最多 400 个细胞的 23,200-cell balanced subset 上构图，得到 29 个 Leiden clusters；这个子集承担结构展示，不承担患者级推断。

组成分析保留两种尺度：raw fraction 便于读者看效应量，经验 logit 用于主要配对检验，公式为：

log((k + 0.5) / (n - k + 0.5))

其中 k 是某个样本中目标细胞数，n 是对应分母，0.5 是预先指定的连续性修正。差异表达先把 raw UMI 按 sample 和 author broad cell type 聚合，再在患者配对样本之间比较 log2-CPM。恶性细胞 site comparison 使用患者级 pseudobulk、Welch 检验、Mann–Whitney 敏感性、协变量 OLS、BH 校正和 leave-one-patient-out 方向稳定性。

Scrublet 在 58 个样本内分别运行，用于敏感性分析。原先调用的自动 histogram-minimum threshold 依赖 scikit-image，在当前环境因 scikit-image/NumPy ABI 不兼容而失败；因此 58/58 个样本统一采用同一 histogram-minimum 思路的确定性本地 glasbey_minimum_local 实现。该实现只生成 sensitivity mask，不替代作者保留分母，不等同于作者原始 doublet 处理，也不把预测 fraction 当成真实 doublet rate。RNA expression-CNV proxy 则使用 GENCODE v49 的基因位置，把 19,412 个可定位基因分到 195 个 chromosome bins，并按患者交叉拟合 nLung epithelial reference。

图 1｜研究设计的分母能否闭合？

图 1 先把样本、患者和 origin 的关系固定下来。58 个样本与 44 位患者逐行对应；右侧重复设计包含 10 位 nLung–tLung 患者，以及 4 位有高级部位重复取样的患者，其中 3 对为 mLN–PE，1 对为 tL/B–PE。每个 patient_id × origin 只有一个样本，因此配对 pivot、pseudobulk 和 malignant-site 统计没有把同一部位的多个样本静默合并。

这张图能支持的设计判断也很明确：重复取样患者只有 14 位，多数部位比较仍是横断面。图中的箭头表示元数据上的重复采样，不能读成 nLN 到 mLN 或 tLung 到 mBrain 的时间顺序。

图 2｜公开保留细胞是否落在作者报告的 QC 范围内？

图 2 关注的是公开保留细胞的 QC 范围。全体 208,506 个公开细胞均通过作者报告的保留阈值审计；全矩阵范围为 UMI 1,000–148,044、检测基因 200–9,750、线粒体比例 0–20%，全体中位 UMI 为 3,489，中位检测基因数为 1,103，中位线粒体比例为 3.530%。为了控制渲染密度，每个来源最多显示 2,500 个细胞，范围和分母审计仍使用完整矩阵。

来源间的中位数并不相同。nLung 的 UMI 中位数为 3,557，tLung 为 3,419，tL/B 为 4,395，mLN 为 3,847，mBrain 为 5,203；mBrain 的检测基因数和 UMI 分布更宽，解离、细胞组成和样本处理差异都会进入后续比较。

这一步只核对 post-author-QC retained denominator。它不能恢复提交前被移除的低质量液滴，也不能替代 Cell Ranger、空液滴、ambient RNA 或原始 reads 的审计；Scrublet 预测同样不能从这张图推出真实 doublet 率。

图 3｜无监督结构是否与作者 broad labels 相容？

图 3 用样本平衡的子集检查无监督结构是否与作者 broad labels 相容。图中使用 23,200 个 sample-balanced cells；全体细胞先进入 PCA 投影，UMAP/Leiden 结构在平衡子集上建立。29 个 Leiden clusters 与作者 broad labels 的 cluster purity 为 0.9602，ARI 为 0.3598，NMI 为 0.6646。T、myeloid、epithelial、B 和 NK 等大类形成可辨认区域，少数 fibroblast、endothelial、MAST 和 oligodendrocyte 群体的点数则较少。

UMAP 距离和群体形状不承担空间坐标、患者级效应或转移路线的含义。少数群体在平衡图中的可见程度受每样本抽样上限影响，图结构也不生成新的 winner-take-all 标签。

图 4｜不使用作者 marker 列表，broad labels 还剩多少表达支持？

作者 broad labels 的独立检查从另一组 marker 开始。9 个 broad labels 使用与 Supplementary Data 2 marker union 零重叠的 held-out marker sets。细胞级描述性 AUROC 范围为 0.8795–0.9994：B lymphocytes 最低，为 0.8795；MAST cells 为 0.9994；myeloid、NK、epithelial、fibroblast、endothelial、T 和 oligodendrocyte 均有较高区分度。可用样本中的正向 contrast 比例为 0.9815–1.0000，B lymphocytes 为 53/54 个样本，其余类别达到 1.0000。

这组结果说明作者 broad labels 在同一 assay 内有表达一致性，但不能独立证明每个 refined subtype、现代 taxonomy 或临床诊断标签。marker 再次画在同一数据上仍属于内部一致性，作者标签依旧是 annotation provenance 的来源。

图 5｜10 对患者的 nLung–tLung 免疫组成变化是否稳定？

图 5 的灰线代表同一患者的 nLung–tLung 配对，重点是方向能否跨患者重复。免疫分母中，B lymphocytes 的 raw mean fraction 变化为 +0.0933，T lymphocytes 为 +0.2082，NK cells 为 −0.1572，myeloid cells 为 −0.1713。主要经验 logit 配对检验经 BH 校正后的 q 值分别为 0.00488、0.0163、0.00488 和 0.0342；剔除 Scrublet calls 后，四个方向和 q 值保持相近。10 位患者的 T 细胞配对方向并不全同，但 8/10 对在 immune-only fraction 上向上；B 细胞为 10/10 向上，NK 为 0/10 向上，myeloid 为 2/10 向上，总体均值仍下降。

fraction 描述的是捕获到的细胞组成，不是组织中的绝对细胞数。解离效率、活性、细胞大小、样本保存和作者过滤都会影响分母。结果支持患者配对的组成差异，但不提供细胞迁移速度、免疫招募机制或治疗响应因果证据。

图 6｜mLN 的 myeloid 富集是关联，还是可以写成转移过程？

图 6 必须按横断面样本来读。mLN 有 7 个样本、nLN 有 10 个样本，来自不同患者和不同取样情境。immune-only fraction 的均值分别为 0.3186 与 0.0330，差值 +0.2856；Welch p=0.0234，Mann–Whitney p=0.000206。这两个 P 值没有对更大的横断面检验家族做校正，只能作为敏感性证据。剔除 Scrublet 后差值 +0.2854，两个检验的方向和量级没有改变；图中已注明患者不配对，collection context 也不同。

因此，图 6 支持的是 mLN–nLN 样本间的 myeloid association。它不能说明 nLN 中的细胞后来进入 mLN，不能估计转移方向，也不能分开患者差异、取样方式、病灶组成和解离偏差的贡献。原论文关于 myeloid infiltration 的讨论可以作为假设来源，不能由这组横断面样本单独升级为机制结论。

图 7｜broad pseudobulk 信号来自细胞内变化，还是 subtype mixture？

图 7 把细胞先按 sample 和 broad cell type 聚合，再看 nLung–tLung 的患者级表达差异。7 个 broad lineages 达到预设条件：每侧至少 20 个细胞，至少 5 对患者。B、epithelial、fibroblast、MAST、myeloid、NK 和 T 的 doublet-exclusion 与主分析 log2FC Spearman 为 0.9885–0.9994，方向对 doublet sensitivity 不敏感。每列选取该 cell type 的前 5 个 display genes，颜色表示配对 tumour-normal log2FC，不表示每个格子的显著性。

把 broad type 与 subtype 作为双层键后，共有 11 个合格 lineage-subtypes。MAST 和 CD8 low T 仍保留多个 q<0.05 且绝对 log2FC≥1 的基因；Follicular B、Alveolar Mac、CD1c+ DCs、Monocytes、mo-Mac、NK、CD4+ Th、Cytotoxic CD8+ T 和 Naive CD4+ T 在这套阈值下大多没有成片的强信号。这个落差说明 broad heatmap 同时受 subtype abundance composition 与 within-subtype expression change 影响。

热图里显著或颜色较深的基因，不能直接写成每个细胞都沿同一方向重编程。subtype 层面的零结果也不等于完全没有变化，可检验配对数少、稀有 subtype 的统计功效有限，仍要回到对应表格查看 pair 数、q 值和方向稳定性。

图 8｜论文的 malignant DE 与患者级 pseudobulk 有多接近？

图 8 把论文的 cell-level log2FC 与患者级 pseudobulk 放在同一坐标上。恶性细胞分母与作者报告一致：tLung 6,352、tL/B 6,400、mLN 2,961、mBrain 15,423。进一步筛选每个样本至少 50 个 malignant cells，得到 tL/B 4 位 target patients 对 9 位 tLung patients，mLN 7 对 9，mBrain 10 对 9。三幅图的 log2FC Spearman 分别为 0.5977、0.6330、0.6508；方向一致比例约为 0.768、0.754、0.776。论文中可匹配且被选为显著 hits 的基因，在患者级 q<0.05 且同方向的比例只有 tL/B 1/198、mLN 0/116、mBrain 1/192。

更严格地要求 q<0.05、绝对 log2FC≥1 和 leave-one-patient-out 方向稳定性≥0.9 后，当前患者级分析得到 tL/B 2 个、mLN 0 个、mBrain 33 个稳定基因。细胞级显著性没有直接转化为患者级显著性，这正是本次复现需要保留的统计差异。

这组比较来自不同患者之间的 site contrast，不是同一患者的纵向转移样本。中等 rank concordance 只能说明表达方向有共享部分，不能写成原论文所有 malignant DE 已被患者级复现，也不能从方向图推断克隆演化或部位因果。

图 9｜tS2 是稳定表达程序，还是一条被图形暗示出来的进展轴？

图 9 要把 tS2 拆成两个问题来看。原论文给出的 tS1、tS2、tS3 signature 分别包含 19、28、79 个基因。把 tS2 基因确定性分成两半后，所有样本的 split-half Spearman 为 0.9238；限定 malignant cells≥50 的样本后为 0.9119。在 tLung 内，连续 tS2 score 区分作者 tS2 label 的描述性 AUROC 为 0.9645，说明这个表达程序可以从矩阵中稳定读出。

site-level 结果没有给出同样强的普遍上升趋势。相对 tLung，tL/B 均值差 −0.0932，mLN +0.1700，mBrain −0.0816；Welch 检验 BH q 都是 0.677。图中 tLung 9 个样本、tL/B 4 个、mLN 7 个、mBrain 10 个，均已按 malignant cells≥50 筛选，mLN 的正方向仍只是描述性现象。

tS2 可以作为可重复的 expression program，但不能把 tS1、tS2、tS3 排成已验证的时间序列。横断面的 anatomical site、单细胞状态标签和 score contrast 不提供 lineage tracing、克隆演化、治疗响应或转移方向；原论文的 Monocle 2 和 TCGA 生存结果也属于本文公开矩阵之外的证据层。

图 10｜RNA expression-CNV burden 是否在配对患者中方向一致？

图 10 的配对比较采用 patient-cross-fitted reference，某位患者的 nLung 细胞不会参与自己的参考均值。19,412 个矩阵基因匹配到 GENCODE v49 位置，组成 195 个 100-gene chromosome bins；参考组为 3,703 个 nLung epithelial cells，作者 malignant cells 共 31,136 个。贡献 nLung 的患者采用 leave-one-patient-out reference，未贡献 nLung 的患者使用全部合格 nLung reference，每个 cell 的参考数为 3,053–3,703。10 对 nLung–tLung 患者的 median burden 差全部为正，平均差 +0.0009241，Wilcoxon p=0.001953。去掉两个 tLung malignant cells 少于 50 的低细胞数患者后，8/8 方向仍为正，Wilcoxon p=0.0078125。

右侧按 origin 展示超过 nLung epithelial 99th percentile 的 fraction。nLung 的中位 fraction 约 0.0077，tLung 约 0.0400，tL/B 约 0.4080，mLN 约 0.4654，mBrain 约 0.7480；这些值是 origin-level burden 分布，不构成 site progression test。

这里得到的是 RNA expression-CNV proxy 与 CNV-informed author-label concordance。细胞级 AUROC 为 0.9338，但作者 malignant labels 本身使用了 inferred expression-CNV，所以 AUROC 只能作为同证据类型的 concordance/sanity check，不能称独立 malignant-label validation，也不等于 DNA copy number、WES、TCGA 或作者原始 CNV classifier 的复现。

图 11｜chromosome-bin 热图能告诉我们什么？

图 11 把同一 proxy 放到 chromosome bins 上，观察 origin 层面的表达型模式。热图汇总 43 个符合 CNV proxy 条件的样本级信号，覆盖 195 个 bins、23 条染色体位置；每个 origin 的行是样本级 bin median 的再次汇总。nLung 的绝对信号整体较窄，tLung、tL/B、mLN 和 mBrain 的幅度更宽，但不同 origin 之间存在大量红蓝交错区域。这样可以检查参考构建和 origin pattern 是否一致。

颜色带仍然只是表达推断的 proxy signal，不能读成 DNA 拷贝数、克隆谱、WES 结果或转移克隆起源。单个色块不能单独支持一个基因组事件，染色体范围的表达变化也可能受到细胞周期、转录状态、参考组成和样本处理影响。

图 12｜58 个样本的 Scrublet 结果能否当作真实 doublet rate？

图 12 只把 Scrublet 当作逐样本的 doublet sensitivity 检查。58/58 个样本完成独立运行，预测 doublets 总数为 1,175，占公开细胞 208,506 的 0.5635%。原先调用的自动 histogram-minimum threshold 因 scikit-image/NumPy ABI 不兼容而失败；58/58 个样本最终统一使用确定性的本地 glasbey_minimum_local 实现，所有样本的阈值方法字段均为该值。样本级 predicted fraction 中位数为 0.003495，范围 0.000193–0.019176；nLN 和 PE 的中位数相对较高，mBrain 的中位数较低，各 origin 内也有明显样本差异。该结果只生成 sensitivity mask，组成和 pseudobulk 在剔除 calls 后仍保留相近方向。

本地阈值实现沿用 histogram-minimum 思路，但不声称与因 ABI 失败的自动实现逐样本等价。predicted fraction 不是真实 doublet rate，也不重现作者原始 doublet handling。模拟 doublet 的 score 会受到细胞状态、样本复杂度和算法环境影响；不能按柱高给样本排序后写成某个组织更容易发生 doublet，也不能把 calls 直接改成新的 primary denominator。

图 13｜PCA 与 sample structure 的变化能证明 batch 已经被去掉吗？

图 13 是 batch/structure sensitivity audit。左侧使用 3,000 个 sample-balanced HVGs 的前 50 个 PC，PC50 累积解释方差为 0.3319。右侧四个 silhouette 分别为：uncorrected author label 0.2931、uncorrected sample −0.1188、sample-centered author label 0.1815、sample-centered sample −0.1802。样本中心化同时降低 author-label silhouette，并使 sample silhouette 更负，说明这个变换会同时改动标签结构和样本结构。

图内副标题已经注明 “Sensitivity only; not batch-removal validation”。这组结果不证明批次已被消除，也不证明 sample-centering 后剩下的差异就是生物学 site signal，更不能据此选择一条因果校正路径。解剖部位、患者、样本处理和 sample 之间存在混杂，公开数据无法在这里把这些因素完全拆开。

把复现结果和原论文主张放在同一张表上

可以在公开矩阵中直接核对的部分

样本、患者、细胞分母和每样本 deposited cell count 全部闭合；保留矩阵内的 QC 范围与作者报告相符；10 对患者的 nLung–tLung immune composition 在经验 logit 配对检验下保留了 B/T 增加和 NK/myeloid 下降的方向；tS2 signature 的样本级 split-half 一致性和 tLung label discrimination 支持它作为可重复表达程序。

方向有共享、证据层级不同的部分

mLN 相对 nLN 的 myeloid fraction 更高，和原论文关于 myeloid infiltration 的观察方向一致，但样本来自不同患者和 collection contexts。malignant-site DE 的 rank correlation 在 0.598–0.651，说明部分表达排序共享，患者级显著性却只保留 1/198、0/116、1/192 个原论文 selected hits。broad-cell-type DE 在 subtype 审计中大量减弱，提示 composition mixture 是解释差异时必须保留的一层。

公开矩阵没有回答的部分

原论文的 Monocle 2 轨迹重建、tS1/tS2/tS3 的时间方向、TCGA LUAD 生存、CellPhoneDB 配体-受体网络、WES 支持的 CNV 证据和全部补充分析，均不在本文公开矩阵能够回答的范围内。因此，本文不声称已经逐图复现这些分析。

处理缺失 subtype 与标签来源

作者 annotation 中有 30,065 个字面 NA subtype，占 14.42%；读入后按缺失值处理，未把它们变成一个名为 nan 的亚群。另有 5,457 个字面 Undetermined，它们是作者明确写入的标签，仍保留在 metadata 里。由于没有一个 Undetermined 组同时满足每侧至少 20 个细胞和至少 5 对患者，最终 11 个 subtype DE 组里没有它。

这个处理决定了文章中的语言：broad labels 是作者 metadata，held-out marker 是与建标签 marker 不重叠的同 assay 留出面板，Leiden 只提供结构背景。文章没有创建新的 winner-take-all identity，也没有把 refined label 的名字改造成新的分类器输出。对于同名 subtype，聚合键始终包含 broad cell type，避免把不同谱系的细胞放入同一 pseudobulk。

深度解读：这篇复现应该怎么读？

这篇复现回答了什么？

它回答的是一个证据组织问题：在公开的 29,634×208,506 UMI 矩阵里，跨部位差异经过患者/样本级约束后还剩什么。最稳的部分是分母链、作者 broad labels 的 within-assay 支持、10 对患者的配对免疫组成和 tS2 expression program 的内部重现。表达型 CNV 结果提供了一个经过患者交叉拟合的 RNA proxy，适合检查 pipeline 是否得到与作者 malignant labels 相容的信号。

这套回答方式也解释了为什么仅看 UMAP 或论文中的 cell-level p 值不够。大矩阵解决了表达覆盖问题，却没有自动增加患者数。样本层的差异方向、配对关系和 site design，决定一条生物学结论可以走多远。

raw / processed matrix 的边界在哪里？

输入是公开的 raw UMI counts，但分母已经是作者保留并提交到 GEO 的细胞。归一化、log1p、HVG、PCA 和程序 score 属于本分析的派生层；raw fraction、empirical logit、pseudobulk log2-CPM 和 CNV proxy 也各自有明确公式。EGA reads 未开放给这次工作，所以不能回溯 read mapping、empty-droplet calling、ambient RNA correction 或提交前细胞排除。

写论文复现时，raw 这个词需要和“未过滤液滴”分开。若把作者保留矩阵写成全量原始数据，读者会误以为 QC 和分母都能从 FASTQ 重建；若把归一化 score 写成原始表达量，又会混淆统计层级。

每张图应该怎么读？

图 1–2 先固定分母和保留矩阵边界；图 3–4 再问结构与 broad labels 是否有表达支持。图 5 的线段代表同一患者两侧的配对变化，图 6 的散点来自不同患者，两个图不能用同一种语法解释。图 7 的热图是 broad pseudobulk effect，必须结合 subtype 审计；图 8 把论文 cell-level log2FC 与患者级 log2FC 放在同一坐标上，重点是 rank concordance 与显著性转移的落差。

图 9 把 tS2 拆成“程序是否稳定”和“site 是否普遍升高”两个问题。图 10–11 的 CNV 颜色来自 RNA proxy，图 12 的柱高来自 Scrublet sensitivity，图 13 的 silhouette 来自结构审计。每一张图的统计单位、输入层和不能推出的结论都不同，不能把 13 张图压缩成一句“发现了转移轨迹”。

哪些地方不能过度解释？

没有纵向取样，就不能从 anatomical site 推出时间方向；没有独立 DNA 或 WES，就不能从 expression-CNV 推出拷贝数事件；没有功能实验，就不能从 ligand-receptor 或表达程序推出机制；没有足够患者配对，就不能把 cell-level significance 当人群效应。组成比例还受解离、捕获、活性和作者过滤影响，malignant-site 比较还受到治疗、基因型、分期、取样位置和未测临床因素影响。

tS2 在 tLung 内部具有高 label discrimination，不等于 tS2 在所有转移部位都增加。mLN myeloid 富集方向清楚，不等于已观察到 nLN→mLN 的细胞迁移。broad DE 颜色很深，不等于每个 subtype 都沿同一方向改变。

如果继续深入，下一步做什么？

若要研究转移方向，需要同一患者的纵向样本、时间标记、克隆或 DNA 层证据，并把 site、治疗和分期放进预设设计。若要拆开 subtype mixture，应增加每个 lineage-subtype 的患者数，或采用能在患者层面分解 composition 与 within-subtype expression 的模型。若要验证 malignant state，应引入独立 CNV/WES、病理标记或空间位置，避免把同一表达证据用于定义标签又用于验证标签。

对于已有 h5ad、Seurat object 或公开 GEO 数据的项目，先补齐样本-患者映射、标签来源和分母链，往往比继续堆叠 UMAP 更能解释结果。然后再决定需要配对组成、患者 pseudobulk、状态程序、CNV proxy、空间验证或功能实验中的哪一层。

局限与可复用的研究判断

公开输入带来的限制

GEO 矩阵不包含未过滤 droplets，EGA reads 受控访问。作者保留的 208,506 个细胞全部通过阈值审计，只说明这个公开分母内部没有超出范围的细胞。它不能评价提交前的细胞排除，也不能重建完整 Cell Ranger 处理链。

组成和解离偏差

细胞比例受 dissociation、capture、viability 和 author filtering 影响。10 对 nLung–tLung 为配对设计中最有力的一层；mLN–nLN、tL/B–tLung、mBrain–tLung 多为跨患者比较。样本层的平均差异不能替代组织总细胞量或流式计数。

差异表达和患者功效

broad pseudobulk 把 subtype abundance 和同一 subtype 内的表达变化放在一起。subtype 审计减少了这种混合，但每个组可用患者数下降，稀有亚群的零结果要保留功效解释。malignant-site 之间没有同一患者的纵向配对；年龄、性别和吸烟状态的 OLS 只能处理有限协变量，不能消除未测混杂。

tS2 与 CNV 证据类型

tS2 是横断面表达程序。本文没有重跑 Monocle 2，也没有用这些图证明 tS1→tS2→tS3 的时间进程。CNV proxy 使用 chromosome-bin 的 RNA signal；细胞周期、转录程序和参考组成都会影响分数。患者交叉拟合解决了“用同一患者 nLung 定义其自身参考”的泄漏，但不会把 RNA proxy 变成 DNA copy number。

软件和数值复现

58 个样本的 Scrublet 均完成，58/58 的阈值方法均为确定性的 glasbey_minimum_local，自动阈值调用的 ABI 错误逐样本保留在运行记录中；不同硬件或库版本可能带来小数位差异。该 sensitivity mask 不代表作者原始 doublet 处理或真实 doublet rate。文章中的方向、分母、配对数和边界来自可重跑的表格与图源登记，图像不以手工复制为依据。13 张图分别对应输入表、作图脚本、参数和文件校验记录，便于在后续公开副本生成前逐项复核。

这类复现能给实际项目带来什么

对已经有单细胞对象、但结果停留在 UMAP 和 marker 表的项目，先把统计单位写清楚，常常会改变结果的可信度。患者配对组成可以判断变化是否跨个体重复；sample-level pseudobulk 可以把细胞数量优势从统计检验中拿掉；subtype 审计可以区分“亚群比例换了”与“同一亚群的表达换了”；与建标签 marker 不重叠的同 assay 留出面板，或来自外部队列的标签与正交证据，可以检查 annotation 是否只是循环自证；状态程序和 CNV proxy 可以作为下一轮病理、DNA 或空间验证的候选问题。

这类工作也适合检查旧项目中的隐性风险：样本名和患者名是否一一对应，是否把一个患者的多个取样当成独立样本，是否把处理后的矩阵叫作 raw，是否把作者标签和新分类混在一起，是否把 site contrast 写成时间轨迹。把这些问题放在图和表旁边回答，通常比单纯增加聚类分辨率更能提高报告的可用性。

小结

Kim 等 LUAD 图谱的公共 GSE131907 矩阵确实能支持一条完整的患者级再分析链：29,634 个基因与 208,506 个作者保留细胞的分母可核对，58 个样本对应 44 位患者，10 对 nLung–tLung 的免疫组成变化在经验 logit 配对分析中保持方向和统计支持，作者 broad labels 有 held-out marker 与平衡结构的表达证据，tS2 可以作为稳定程序重现。

同一套证据也给出了几条清晰的止步线。mLN myeloid 富集是横断面关联；论文 cell-level malignant DE 的大部分显著性没有转移到患者级推断；tS2 site contrast 没有支持普遍增加；expression-CNV 只能叫 RNA proxy 和 CNV-informed concordance；Figure 13 只能做结构敏感性审计，不能当作 batch removal validation。

对于一篇单细胞论文，复现的产出不应只有一张相似的 UMAP。把矩阵层、样本设计、患者重复、图表输入和推断边界同时写出来，读者才看得见哪些结果可以直接使用，哪些结果适合做下一轮实验假设，哪些问题还需要新的数据才能回答。