Kang et al. 的 IFN-beta PBMC 数据经常被当作单细胞入门案例使用，因为 control 和 stimulated 的对比清楚，PBMC 细胞类型熟悉，IFN marker 也容易验证。本文把刺激响应从单细胞级别的视觉差异退回到 individual、原文 metadata 和细胞类型内配对差值。
统计与注释修订（2026-07-19）： 28,871 个 QC 后细胞中，28,559 个能对齐作者 batch2 metadata；按
multiplets == singlet保留 24,250 个细胞和 8 个 original individual。individual 级主分析使用作者paper_celltype，CellTypist broad label 只用于交叉表和一致细胞敏感性分析。22,622 个细胞在两套标签间一致，占 93.3%。每个 individual × condition 至少需要 10 个细胞才进入公开汇总。Megakaryocytes 仅有 20/203 个细胞与 broad label 一致，敏感性子集没有达到展示门槛，因此不把该群体写成稳定的跨注释结论。归一化表达聚合只用于方向复核，未作为 raw-count pseudobulk 或 cell-level 显著性检验。
这篇文章是在公开 GSE96583 batch2 基础复现之后的加深分析。基础复现已经回答了矩阵能否读入、主要 PBMC 群体能否恢复、IFN marker 是否在 stimulated 组上升。这里继续把作者 batch2 metadata 对齐回来，检查 original individual、原文 cell type、singlet/doublet 标记、现代 broad annotation 的交叉关系，并把 IFN 响应从“所有细胞混在一起看”推进到 individual 和 cell type 内部。
本文不声称完整重跑原文方法学。分析目标是形成可审计的判断链：数据来源是否清楚，metadata 是否能接回原文，细胞身份是否能被两套标签互相支持，stimulated-control 差异是否跨 individual 稳定，哪些部分必须留给 FASTQ、genotype、demuxlet 或 donor-aware 模型。
为什么需要加深分析？
Kang et al. 这组数据很适合作为单细胞复现样板，但“能画出 UMAP”和“能做成加深分析案例”不能混为一谈。轻量复现可以回答公开矩阵可读性、PBMC 主要细胞类型和 IFN marker 上升；加深分析进一步检查细胞与作者原始 metadata 的对齐、原文 cell type 与现代参考注释的一致性，以及 IFN 响应在 original individual 层面的稳定性。
这一步需要先确认。给科研项目服务时，客户关心的往往不是“有没有图”；结果是否经得起追问：数据从哪里来、metadata 是否可靠、样本设计有什么边界、细胞类型注释是否能和原文互相印证、差异结果是否只是单细胞伪重复造成的表面显著。
在刺激实验或疾病分组的单细胞项目里，最常见的误读有两类。一类是把 cell-level 的显著差异当作样本层面的结论。一个条件里细胞数更多，或者某个 donor 贡献了更多细胞，都可能让箱线图看起来很有差别。另一类是把组成变化和细胞内部状态变化混在一起。比如某个 IFN marker 在 stimulated 组更高，可能来自同一类细胞内的转录上升，也可能来自 stimulated 组里天然高表达该 marker 的细胞类型比例更高。
Kang 这组数据的好处是，它同时给了我们两个层面的材料：表达矩阵可以重建 PBMC 图谱，作者 metadata 又能把细胞接回 original individual 和原文 cell type。只要把这两层连起来，文章就能从“复现了一组漂亮图”变成“说明了刺激响应应该怎样被审计”。这也是深度复现和普通图谱复现的区别。
这篇加深分析要拆开的三个问题
这篇文章围绕三个具体问题展开。第一个问题是数据层级：公开矩阵和作者 metadata 能支持什么，不能支持什么。GEO RAW 文件里的 batch2 control/stimulated 矩阵足够做表达图谱和细胞级比较，作者整理的 batch2 metadata 又能提供 original individual、原文 cell type 和 singlet/doublet 标记；但这些材料仍然不能替代完整 FASTQ 重比对、genotype-aware 拆分或 eQTL 模型。
第二个问题是细胞身份：作者 cell type 和现代 broad annotation 是否大体一致。individual 级比较以作者标签为主，现代标签承担敏感性核验。两套标签出现明显分歧时，结论需要收窄，不能让缺少 posterior 和拒绝规则的自动标签单独决定比较分组。
第三个问题是响应证据：IFN response 是否在 individual 层面也成立。28,000 多个细胞仍来自 8 个 original individual，生物学重复数不会随细胞数同步增加。因此，深度复现把每个 original individual 在作者细胞类型内的中位 response score 单独列出，再讨论 stimulated-control 的方向和强弱。
论文和公开数据来源
- 论文：Kang HM et al., Nature Biotechnology 2018
- DOI：10.1038/nbt.4042
- PubMed：PMID: 29227470
- 公开数据：NCBI GEO GSE96583
本次加深分析仍然聚焦 batch 2 的 control 和 IFN-beta stimulated PBMC。使用的主体矩阵来自 GEO RAW 文件中的 GSM2560248 和 GSM2560249，同时补充读取 GSE96583_batch2.total.tsne.df.tsv.gz 中的作者整理 metadata。这个 metadata 包含 original individual、stim、原文 cell type、cluster 和 singlet/doublet 标记，是把公开矩阵复现从“表达图谱”推进到“原文对照”的关键材料。
**复现边界：**本文没有做 FASTQ 级重新比对，也没有完整复刻原文 demuxlet、genotype、eQTL 和 donor-level genetic interaction 模型。本文做的是公开矩阵与作者 metadata 层面的深度复现：确认细胞、条件、individual、cell type 和 IFN 响应是否能形成可核查的证据链。
这里要把“公开 RAW 文件”说清楚。GEO RAW 目录提供 count matrix、barcodes/features 和作者整理后的 metadata，无法恢复 FASTQ 比对、去重、cell calling 和 demuxlet 的全部过程。本文可以讨论表达矩阵中的细胞类型、IFN marker、response score 和 original individual 层面的稳定性；遗传变异拆分方法和 eQTL 分析仍需原始 reads、genotype 与原文模型。
这个边界对真实项目很实用。很多公开数据或客户旧对象只有 h5ad、Seurat object、matrix 或作者 metadata，已经没有完整 FASTQ 或原始样本表。这样的材料可用于能做细胞注释复查、marker 程序审计、组成比例比较、individual-level aggregate；如果要回答个体遗传效应、精确差异表达显著性或批次校正后的因果解释，就要补回样本设计和上游信息。
数据规模和 metadata 对齐
- QC 后细胞：28,871
- 作者 singlet 过滤后：24,250
- QC 后基因：15,586
- 匹配原文 metadata 的细胞：28,559
- original individuals：8
- 作者标签与 broad label 一致细胞：22,622 / 24,250（93.3%）
加深分析先做数据溯源检查。QC 后对象中共有 28,871 个细胞和 15,586 个基因，其中 28,559 个细胞能和作者 batch2 metadata 成功对齐；按作者 multiplet 字段过滤后保留 24,250 个 singlet。后续 original individual、原文 cell type 和响应汇总均使用这批 singlet。
图 1 展示 QC 后 control/stimulated 细胞数量、原文 singlet/doublet 标记、每个 original individual 的细胞数，以及作者原文 cell type 在两个条件下的保留情况。深度复现要先确认 metadata 能不能对齐，再讨论响应差异。
这张图有两个作用。第一，它确认 control 和 IFN-beta stimulated 两组细胞规模接近，避免后续结果被极端样本量差异主导。第二，它把作者 metadata 带回分析对象，说明后续不只在现代注释标签上讲故事；它可以和原文整理结果互相校验。
更细一点看，28,871 个 QC 后细胞中有 28,559 个能对回作者 metadata，这意味着大部分细胞不仅有表达矩阵里的 barcode 和条件标签，还能带回 original individual 和作者原文 cell type。深度复现里，这个比例比单纯细胞总数更有价值。因为后面的结论如果要从“stimulated 组细胞分数更高”推进到“多个 individual 都有同方向响应”，就必须知道每个细胞来自哪个 original individual。
这张图还提醒我们，singlet/doublet 标记不能被忽略。PBMC 混池单细胞数据里，doublet 或未能可靠分配的细胞会影响细胞类型和条件解释。本文不是重新运行 demuxlet，但作者 metadata 中已有 singlet/doublet 信息，可以把它作为公开层面的质量参照。深度复现至少要说明这些信息是否被保留、是否能和当前对象对齐；否则后面的细胞类型内响应就会缺一块基础证据。
从项目交付角度看，数据溯源图的功能也很明确。客户或读者最怕的是只看到结果图，不知道中间丢了多少细胞、哪些 metadata 被保留、哪些标签来自作者、哪些标签来自后续注释。把这些信息放在文章前面，可以让后面的每张图都有出处，也能减少读者对“是不是重新编了一套标签”的疑问。
原文 cell type 与现代注释的交叉验证
公开复现里，细胞类型注释不能只依赖一种标签。原文已经提供了 cell type 信息，现代参考模型也可以给出 broad annotation。两者如果完全冲突，就必须回到 marker 或 metadata 重新检查；两者如果大体一致，才适合继续做细胞类型层面的 response 解读。
图 2 把作者 cell type 与现代 broad annotation 做交叉表。CD4 T、B、CD14+ monocyte、FCGR3A+ monocyte 和 NK 的对应率较高；CD8 T 与 dendritic cell 存在更多交叉；Megakaryocytes 只有 20/203 个细胞被 broad label 标为 PLATELET。后续主分析保留作者标签，交叉表用于判断敏感性边界。
这个 crosswalk 回答的是两套标签能否互相支持。主要 PBMC 群体整体对应良好，但不同群体的可靠程度并不相同。作者标签因此作为 individual 级响应分析的主分组；现代 broad label 只用于构建一致细胞子集，检查主要响应方向会不会随注释来源改变。
如果这一步不做，后面的解释会变得很脆弱。比如把原文 CD14+ Monocytes 和 FCGR3A+ Monocytes 都合并到 broad myeloid 层面时，必须确认这种合并不会掩盖主要响应方向；把 CD4/CD8 T cells 放到 broad T CELL 层面时，也要清楚它适合看总体 IFN response，不适合替代更细的 T 细胞亚群分析。
这张 crosswalk 也决定了后文哪些地方可以合并，哪些地方要保留边界。CD4 T、CD8 T 和 NK 不能压成一个笼统的“淋巴细胞响应”；当前材料又不足以稳定拆分更细的 T cell state。本文保留作者的 8 类 cell type，并用 broad label 一致子集做敏感性复核。
Myeloid 部分也类似。原文中的 CD14+ Monocytes、FCGR3A+ Monocytes 和 dendritic 相关标签，在现代 broad annotation 中会有不同程度的合并和交叉。这个交叉表说明主要方向可以对上，但它也提示后续要谨慎：myeloid 的 IFN score 较高可以作为髓系相关响应线索；若要写成单核细胞亚群的机制差异，需要回到更细标签、marker panel 和 donor-aware 统计模型。
很多复现文章会直接给一张 annotated UMAP，然后进入 marker。这样读起来快，但科学风险高。细胞标签一旦错位，marker score、composition、trajectory 都会跟着错。Kang 这篇深度复现保留 crosswalk，是为了把“原文标签”和“现代注释”放到同一张表里接受检查。这个步骤不花哨，但比额外堆一张 UMAP 更能提升可信度。
individual 层面的 IFN response
上一版文章已经说明 stimulated 组整体 IFN response score 明显上升。但加深分析还要进一步看：这种上升是否在 original individual 层面稳定存在。因为如果只看所有细胞混在一起的分布，很容易受到细胞数、组成或某个 individual 的影响。
图 3 以 original individual 为单位，展示作者 cell type 中 control 与 IFN-beta stimulated 的 IFN marker score。每个点对应一个 individual 在一个作者细胞类型内的中位响应；单个 individual × condition 少于 10 个细胞的组合不进入公开汇总。
从 individual 层面看，CD4 T、CD8 T、NK、B、CD14+ monocyte、FCGR3A+ monocyte 和 dendritic cell 的 stimulated 分数普遍高于 control。Megakaryocytes 的作者标签汇总也呈正向变化，但细胞数偏少，且与 broad label 的一致性很低，因此单独降级为探索性结果。
图 4 直接计算每个 original individual 的 stimulated-control 中位 score 差值。蓝色使用全部作者标注 singlet，棕色仅使用作者标签与 broad label 一致的细胞。CD4 T、CD8 T、NK、B、两类 monocyte 和 dendritic cell 在两套分析中方向接近。Megakaryocytes 的一致子集没有任何 individual × condition 组合达到 10 个细胞，因此只显示作者标签结果。
这张图把“刺激组更高”落实为多个 original individual 的配对差值，并检查结果是否依赖 posterior 缺失的自动标签。主要群体在作者标签和一致细胞子集中方向接近，说明 IFN 响应主线较稳；Megakaryocytes 的注释与细胞数边界也被明确暴露出来。该图仍是描述性配对汇总，未替代 donor-aware 统计模型。
individual 层面的图要按点来读，而不是只看箱体或平均线。每个点代表某个 original individual 在某个 broad cell type 内的中位 response score。这个设计把细胞级信号压回更接近生物重复的层面，避免一个细胞数特别多的个体主导总体分布。对刺激实验来说，这一步很关键：如果 stimulated 组整体高，但只有一个 individual 拉高，文章就不能写成稳定响应。
图 4 的 stimulated-control delta 更进一步。读者无需分别比较两组分布，可以直接查看同一个 original individual 在同一类细胞中的差值。T cell、myeloid、ILC、B cell 和 dendritic cell 的差值都为正，说明 IFN-beta 刺激方向在主要 PBMC 群体中相当一致。髓系和树突状细胞相关群体的响应更强，符合干扰素和抗原呈递相关细胞的生物学预期。
这里仍然要守住边界。original individual 层面的中位数差值不是完整统计模型，不能替代 donor-aware differential expression。它更像一个严肃的中间层：比所有细胞混合后的 score 更稳，比完整广义线性模型或混合模型更轻量。公开复现文章可以把它写成“响应方向稳定、适合继续做细胞类型内差异分析”，不宜写成“已经完成 donor-level 显著性检验”。
这一步也解释了为什么本文不把 IFN response 只放在 UMAP 上展示。UMAP 适合看空间位置和群体覆盖，但不适合当作样本层级证据。individual-level score 和 delta 图把问题从视觉分离拉回实验设计：同一个 original individual 在 control 和 stimulated 条件下是否有一致方向的变化。这才是刺激实验更应该追问的层级。
IFN marker 在细胞类型和条件中的均值表达
随后把 14 个经典 IFN marker 放到 cell type x condition 层面做均值表达对照。这里的目的不是发现新 marker；重点是检查已知 ISG/IFIT/MX/OAS/STAT/IRF 轴是否在不同免疫细胞群中成组上升。
图 5 先在每个 original individual、作者 cell type 和 condition 内计算 marker 平均归一化表达，再取 individual 中位数汇总。ISG15、IFIT1/2/3、MX1/2、OAS1/2/3、STAT1、IRF7、IFI6、IFI27、RSAD2 在 stimulated 条件中成组增强。
这个图适合解释“为什么 response score 可信”。如果 score 上升只是由一两个基因驱动，那么它的解释价值有限；但这里多个经典 IFN marker 在多个细胞类型中方向一致，说明 response score 捕捉到的是一组协调的干扰素反应。
individual-level aggregate heatmap 把单细胞层面的稀疏表达先退回生物学重复，再汇总 cell type × condition 模式。单个细胞里某个基因未检出，不代表这个基因在该细胞类型没有响应；单个 feature plot 上颜色很亮，也不代表整个 IFN 程序成立。把 14 个 IFN marker 放到同一张热图里，可以检查多个 individual 是否给出一致方向。
这里检查的 marker 包括 ISG15、IFIT1/2/3、MX1/2、OAS1/2/3、STAT1、IRF7、IFI6、IFI27 和 RSAD2。这些基因覆盖 interferon-stimulated genes、抗病毒相关反应和 JAK-STAT 轴下游的常见读出。它们在 stimulated 条件中整体增强，说明 response score 不是从一个孤立 marker 硬推出来的。
热图还可以帮助发现异常。如果某个细胞类型只有一个 marker 变高，或者 IFIT/MX/OAS 方向互相打架，就要检查表达矩阵、注释或低丰度细胞的稳定性。当前结果显示多个 marker 在主要细胞类型中同向上升，支持把 IFN-beta 响应作为这组数据的主体解释。低丰度群体仍然要谨慎，因为均值表达容易受少量细胞影响。
细胞类型内 paired individual marker delta
加深分析还生成了细胞类型内 stimulated-control 的配对 individual 差值表。每个基因先按 original individual、cell type 和 condition 聚合，再在同一 individual 内相减。该表检查方向一致性，不替代 raw-count donor-aware 差异表达模型。
图 6 汇总同一 original individual 内 IFN marker 的 stimulated-control 配对差值，并按作者 cell type 取 individual 中位数。CD4/CD8 T、NK、B、CD14+/FCGR3A+ monocyte 和 dendritic cell 中均能看到成组 IFN marker 正向变化；Megakaryocytes 受低细胞数限制，只保留描述性阅读。
在 T cell 内，ISG15、IFI6、IFIT3、IFIT1、MX1、IFIT2、OAS1、IRF7、RSAD2、STAT1 等 marker 都排在 stimulated-control 均值差较高的基因中。类似趋势也出现在 myeloid、B cell、ILC 和 dendritic cell 中。这个结果和原文关于 IFN-beta 刺激诱导广泛 interferon-stimulated genes 的方向一致。
配对差值表的读法和传统差异分析表不同。这里看的是 stimulated-control 的均值差、表达比例差和 IFN marker 标记，重点是判断一组已知 marker 是否在细胞类型内部同向移动。它适合回答“信号是否进入了这个 broad cell type”，不适合单独回答“哪个基因是严格显著差异基因”。
CD4 T 和 CD8 T 中多个 ISG 及 IFIT/MX/OAS 相关基因共同上升，说明 T cell 内部存在清楚的 IFN 程序。CD14+ 与 FCGR3A+ monocyte 的响应幅度更高，dendritic cell 也呈同方向变化。B cell 和 NK 的方向稳定。低丰度 Megakaryocytes 仍需更多细胞和独立注释证据。
这个表最大的作用是把图上的现象转成可检查的基因列表。读者可以看到哪些 marker 支撑了 response score，也可以判断结论有没有只依赖一两个显眼基因。深度复现应该给读者留下可复查材料，而不是只给结论句。对于后续项目，这张表也能直接转化为细胞类型内 DE、gene set score 或 pseudobulk 模型的候选输入。
从“细胞很多”退回到“样本证据”
单细胞文章很容易给人一种错觉：细胞数越多，结论就越稳。Kang 这组数据有 28,000 多个 QC 后细胞，但 biological replicate 仍然来自 original individual 和实验条件。深度复现要做的事情，是把细胞数量带来的视觉优势和样本层级证据分开。
本文用三层结果处理这个问题。cell-level UMAP 和 marker 图负责确认表达信号存在；individual-level aggregate heatmap 检查一组 marker 的方向；original individual 层面的 score 和 paired delta 观察响应是否跨个体稳定。
这也解释了为什么单细胞复现报告不能只追求图多。图多但层级重复，读者仍然不知道结论是否稳。Kang deep 需要展示的是审计顺序：数据对齐、注释交叉、individual 层面、marker 组、配对差值边界。每一步回答一个不同问题，合在一起才构成加深分析。
如果把这套逻辑放到真实免疫项目中，最常见的下一步是细胞类型内 pseudobulk 或 mixed model。比如在 T cell、B cell、myeloid、DC 内分别把 stimulated 和 control 做差异表达，加入 donor 或 batch 因素，再看 IFN-I response、antigen presentation、inflammatory response 等 gene set 是否一致。本文没有走到完整统计模型，但它已经把哪些结果值得继续建模、哪些结果只适合作为线索讲清楚。
和原文的关系
Kang et al. 原文的主线是 multiplexed droplet scRNA-seq 和 demuxlet 方法，利用自然遗传变异进行样本拆分，并在 IFN-beta PBMC 中展示细胞类型特异响应。本文加深分析并不声称完整复刻 demuxlet 和遗传调控部分；关键在于把公开 batch2 表达矩阵和作者 metadata 用于更细的响应复现。
本次深度补充和原文一致的地方包括：control vs IFN-beta stimulated 的实验设计，PBMC 主要细胞类型结构，ISG/IFIT/MX/OAS/STAT/IRF 相关 marker 的整体上调，以及髓系/树突状细胞相关群体更强的响应趋势。
没有复现的部分也必须写清楚：没有重新从 FASTQ 比对，没有重跑 demuxlet，没有做 genotype-aware eQTL，也没有把 exploratory paired-delta table 写成完整 donor-aware differential expression。对于公开 blog 来说，这种边界说明比过度包装更重要。
和原文对照时，还要注意原文的主角并不是“IFN marker 能不能上升”这么简单。Kang et al. 用这组数据展示的是 multiplexing、natural genetic variation、demuxlet 和细胞类型特异响应的组合。本文只取了其中适合公开矩阵复现的部分：batch2 control/stimulated 的表达矩阵、作者 metadata、原文 cell type 和 IFN 响应。
这个选择有实际意义。很多读者手里拿到的是一个公开矩阵、一个 metadata 表、一个 h5ad 或一个 Seurat object，原文所有上游材料未必齐全。此时更可取的做法是把现有材料能支持的部分做深，而不是声称完整还原论文。Kang 这篇可以支持“公开矩阵和作者 metadata 层面的 IFN 响应复查”；不能支持“完整重做 demuxlet 和遗传调控模型”。
如果以后要把这篇继续推到更深层，方向也很清楚。需要把更多 batch、更多 donor 或原始 genotype/demuxlet 结果接回来；在细胞类型内做 donor-aware 差异表达；把 eQTL 或 genetic interaction 的结论和 IFN marker response 串起来。那些工作会回答另一个问题：遗传背景如何调节细胞类型特异的 IFN 响应。本文还没有到那个层级，因此不会把探索性配对差值写成遗传调控结论。
类似项目可以复用的审计顺序
这篇复现可复用的地方，是它给刺激实验提供了一套审计顺序。遇到 control/treatment、感染/未感染、治疗前/治疗后这类设计时，先不要急着做通路富集。文章或报告应该先确认五件事。
- 矩阵和 metadata 能不能对上。没有样本、condition、donor 或 cell type metadata，后面的比较层级会很低。
- 主要细胞类型是否稳定。注释要能被 marker 或原文标签支持，不能只依赖一个自动标签。
- 组成比例是否影响总体信号。某个响应细胞类型比例升高时，总体 marker 差异会被放大。
- 响应是否在细胞类型内部出现。同一类细胞里的 stimulated-control 差异，比所有细胞混在一起更有解释价值。
- 样本层级是否支撑结论。individual、donor、patient 或 batch 层面的方向不一致时，结论要降级。
这个顺序会让文章显得“慢”，但它能挡住很多常见误读。单细胞深度复现要把每个结论放到合适的证据层级里，不能把一个数据集拆成更多彩色图就算完成。Kang 数据适合作样板，因为它同时有清晰刺激设计、熟悉的 PBMC 细胞类型、经典 IFN marker 和可对齐的作者 metadata。
深度解读：这篇复现应该怎么读？
这篇深度复现回答了什么？
在 GSE96583 batch2 的公开矩阵和作者 metadata 层面，Kang IFN-beta PBMC 可以形成一条可核查的响应证据链。metadata 高比例对齐，作者 cell type 与 modern broad annotation 在主要群体中大体一致，多个 IFN marker 在多个 original individual 中同向上升。Megakaryocytes 的跨注释一致性不足，已从稳定结论中剔除。
更具体地说，大多数细胞能接回作者 metadata；主要 PBMC 群体在作者 cell type 和 modern broad annotation 之间能够对应；作者标签主分析与一致细胞敏感性分析给出相近方向；多个 marker、individual aggregate 和 paired delta 共同支持 control/stimulated 的响应差异。
raw / processed matrix 的边界在哪里？
这里使用的是 GEO 公开矩阵和作者整理 metadata，不是 FASTQ 级重新比对。它比只用 processed summary 更深入，因为保留了 count matrix、barcodes、features 和作者 batch2 metadata；但它仍不能恢复原文完整上游测序、demuxlet genotype 模型和所有 donor-level 分析。
这个边界会影响文章写法。可以写“公开矩阵和作者 metadata 支持 IFN-beta stimulated 条件下的多细胞类型响应复查”；不能写“完整复现了 Kang et al. 的 demuxlet 方法学和遗传调控分析”。如果要做后者，需要原始 reads、genotype 信息、完整 donor 设计和原文统计模型。
主图应该怎么读？
先看数据来源和 metadata 保留，确认细胞能对回原文；再看原文 cell type 与现代注释交叉表，确认注释没有明显跑偏；然后看 individual 层面的 IFN response，判断 stimulated-control 差值是否稳定；结尾处看 IFN marker individual aggregate 和 paired delta，确认响应不依赖单个基因或 pooled cell mean。
这几张图的顺序不能随意调换。先看 IFN marker 会让读者忽略 metadata 和样本层级；先看 paired-delta table 又会显得像在做严格 DE。比较合适的读法是从数据可信度开始，再进入细胞身份，随后讨论 individual 层面的响应，marker heatmap 和配对差值表则作为基因证据。
哪些地方不能过度解释？
不能把归一化矩阵上的 individual aggregate 写成 raw-count pseudobulk DE；不能把 broad annotation 当成原文所有亚群标签；不能把 batch2 两个 GEO 矩阵扩展成完整论文复刻；也不能把这篇文章包装成 demuxlet 方法学完整复现。本文完成的是公开矩阵和 metadata 层面的深度复查。
还要避免把响应强弱写成功能机制。Myeloid 和 dendritic cell 相关群体的 IFN response 更强，符合免疫学预期，但这仍然是表达层面的结果。它不能直接说明某个细胞类型在体内承担了更强抗病毒功能，也不能推出 donor 遗传背景对响应的调控方向。若要回答这些问题，需要功能实验、更多样本或原文遗传模型。
如果继续深入，下一步做什么？
继续深入时，最值得补的是 cell type 内 donor-aware differential expression。T cell、B cell、myeloid、DC 和 ILC 不应该被混在一起做一个总体 stimulated-control 对比；每个细胞类型内部都要按 original individual 或 donor 层级汇总，再做差异表达和 gene set score。这样才能区分组成变化、细胞内部状态变化和个体差异。
另一个方向是把 IFN response 拆成更细模块。ISG/IFIT/MX/OAS 代表的是经典 IFN-I 读出，STAT1/IRF7 更接近转录调控轴，antigen presentation、inflammatory cytokine 和 interferon-stimulated chemokine 可以继续单独成组。不同细胞类型中这些模块是否同步上升，能比一个总 score 提供更细的解释。
如果能补回原文更完整的 donor/genotype 信息，还可以回到 Kang et al. 的方法学主线：自然遗传变异如何帮助样本拆分，以及不同个体的 IFN 响应是否存在遗传调控差异。那会是比本文更高层级的复现，不应和当前公开矩阵层面的深度复查混写。
小结
Kang IFN-beta PBMC 适合作为深度复现样板，是因为它既有清楚的生物学刺激设计，又有公开矩阵和作者 metadata，可以从基础图谱复现推进到 original individual、原文 cell type 对照和细胞类型内 IFN marker 配对差值。
这类深度样板展示的是一套可复查的工作方式：确认数据来源，接回 metadata，交叉检查注释，把响应退回到 individual 层面，再用 marker heatmap 和配对差值表支撑解释。结论写到哪里，取决于证据能支撑到哪里。
对于类似刺激实验、感染模型、治疗前后或疾病分组项目，这个顺序比单纯增加 cluster 数更实用。图谱复现解决“数据能不能读、主要细胞能不能识别”；深度复现要继续回答“差异来自组成还是状态、样本层级是否稳定、哪些结论能进入正文、哪些还要补模型或实验”。Kang 这篇的重点就在这里。